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安德森和Kearney的早期工作[5]支持沿着重复连续核对肌肉耐力的支持。这些研究人员分配了43名未经训练的年轻人，以便在高（3组6至8rm），中等 - （2套30至40rm）或低（100套100至150rm）负荷上进行替补卧室9周的研究期。在每个参与者的1RM的40％的40％评估相对耐久性，并且在所有参与者〜27公斤评估绝对耐久性。结果表明，低负载基团的绝对肌肉耐力增加了41％和39％（〜15重复的增加），而高负荷集团实现了28％的增益（增加〜9 rep- etitions）。与高负荷组中的降低7％相比，相对肌肉耐久性的增加分别为22％和28％，而低负载基团相比。通过石头和Coulter的后续研究[6]在使用高度 - （3套6至8 rm），中等 -（2组15至20rm）或低（1套30至40rm）负载。使用绝对和相对评估，对上半身（台压和下蹲）进行肌肉耐力测试。对于绝对的评估，上身的增益肌肉耐久性有利于中负荷条件，与高负荷条件相比（分别为44％，分别为31％和20％），与重复连续统一体不一致。或者，下半身肌肉耐久性评估表现出符合拟议重复连续体的结果，观察到的增加84％，80％和137％，分别用于高载荷和低负荷。基于预测试RM的肌肉耐久性的相对评估结果与绝对评估中观察到的相似性。上半身的结果显示U形反应，分别增加了58％，67％和54％，分别为高，中等和低负荷。另一方面，下半身肌肉耐久性有利于培训，低（83％）与高（66％）和中等 - （61％）负荷相比。这些发现表明，局部肌肉耐力的重复连续效果似乎与下半身比上身肌肉组织更相关。请注意，安德森和Kearney [5]和石头和Coulter [6]研究中的“中等”和“低”负载条件采用重复范围> 15 rm，包括重复连续体的“耐力”方面。此外，对较轻的负载条件进行的套数逐渐减少，这些研究提出了关于在肌肉耐久性的情况下是否显示出优势的问题，如果套装已经等同于体积负荷。目前尚不清楚为什么上肢和下肢之间存在肌肉耐久性的粘性差异，而相对于强度或肥大结果没有看到这种效果;需要进一步的研究来更好地理解这种明显的现象。 在解释证据时，重要的方法考虑与使用预干预或干预后1RM值有关。具体地，一些研究评估了在肌肉耐久性对不同加载方案对不同装载方案的影响使用预先干预（基线）1RM值来确定耐久性测试的负荷，而其他使用后介入性值[20,31]。例如，如果一组参与者在预介入测试中按100千克的平均1RM，则我们使用60％的1RM用于肌肉耐久性测试，负载将设定为60千克。但是，如果参与者在干预后的1RM增加到120公斤，那么初始测试中使用的60千克现在将达到新建立的1RM的50％，这将自然地改变一些生理需求测试。另一种选择是根据新建立的1RM重新调整干预后测试中的重量。在我们的示例中，干预后1RM为120千克，肌肉耐久性测试的新负载将设定为72千克。然而，这种方法的限制是它使测试中的值偏向低负载条件。如前所述，高负荷训练通常导致1RM的增加，因此还需要在肌肉耐久性评估中使用更高的载荷[10]。实际上，我们的组[20]在与中等-（8至12rm）载荷相比，在低（25至35 rm）的训练时，对相对上身肌肉耐久性（卧式压力机50％1rm）的提高表现出更大的改善。然而，后期后测试基于后期后1RM，可想象的偏置导致低负荷条件。或者，局部肌肉耐力测试基于研究前1RM的研究倾向于驳斥低负荷训练对这一结果的益处。Jessee等人[31]显示，在进行为期8周的训练计划（使用15%或70%1RM的负荷）后，在单侧膝盖伸展中，在测试前1RM的42.5%评估下，相对肌肉耐力也有类似的增加。最近，Buckner等人[79]发现，在试验前1RM的42.5%时使用肘关节屈曲来评估相对肌肉耐力，在高（70%1RM）和低（15%1RM）负荷条件下，负荷没有影响。鉴于使用预干预前的研究之间观察到的差异结果与干预后1RM值用于确定肌肉耐久性测试中的负载，未来的研究可以考虑使用两种测试方法。使用预先干预和干预后的肌肉耐力评估1RM值可能需要多天的测试，这可能会出现一些后勤限制。尽管如此，石头和Coulter的早期工作采用了这种方法[6]。在该研究中，当使用预先服用前1RM值时，所有基团都经历了肌肉耐久性的增加。然而，当将负载重新调整到干预后1RM值时，均未在上体内耐久性的增加，并且对于低体内，在6-8RM培训的组中发现显着增加（31％;〜11重复）和培训30-40rm的组（33％;〜10重复）。在15-20欧元的组培训中没有观察到显着差异，这将否定重复连续内提出的理论。 另一种选择是使用肌肉耐久性测试，不会受到1RM值变化的影响。例如，一项研究比较了培训对80％1rm的培训对培训的影响，培训具有40％的1RM [29]。参与者进行了一种等级试验，评估了总工作，被认为是肌肉耐力的代理。在这项研究中，40％1RM的团体培训经历了总工作的15％，显着大于80％1RM组（5％）中观察到的增加。因此，当使用等动力学任务中的总工作来测量肌肉耐力时，重复连续内容似乎有效。尽管如此，这一发现仅基于一项研究，突出了对未来研究的需求。比较重载和中等负荷训练的影响的研究表明条件之间肌肉耐久性的增加[21,24]。这表明对该主题缺乏剂量响应关系。因此，如果实际上存在对肌肉耐久性的负荷诱导的影响，这仍然是可疑的，它似乎仅限于重复连续体的远方方面。表3列出了对该主题的研究摘要。5.结论尽管普遍接受重复连续体作为加载范式，但目前的研究未能支持其一些潜在的推定。考虑到文学的身体时，可以绘制以下基于循证的结论，提出了用于锻炼处方的新装载范式（见图2）。 图2.电阻训练有关负荷特定适应的现有证据摘要。证据支持重复的连续uum关于使用动态恒定电阻运动的1RM测试造成的肌肉强度。这至少部分可以归因于测试在研究方案中使用的运动中通常进行测试，这提供了更好地转移与特异性原则一致的培训。或者，当在等距器件上进行测试时，在负载条件之间的强度相关的改进几乎没有差异。这些发现与运动表现有关的实际意义以及仍有仍有待开展日常生活活动的能力。关于肥大，文献的令人信服的身体表明，可以在宽的载荷范围内实现类似的整个肌肉生长（即肌肉厚度，CSA）〜30％1RM。这些发现与年龄和培训状况无关。因此，作为一个原则，没有理想的“肥大区”。然而，从实际的角度来看，鉴于光负荷训练与使用较重负载相比，既有载重量相比，可以提出适度负荷提供最有效的载荷手段，以便进行更多的重复，这又增加了培训的时间越来越多的重复。此外，伴随光载荷的高水平代谢酸中毒趋于引起不适[81]，这又可以产生负面影响。或者，证据表明，重载训练需要更多的组，以实现相当的肥大到中等负荷。不仅从a效率低下时间立场，但高训练量的重负荷的组合提高了关节相关的应力，增加了过度训练的可能性。急性[40,41]和纵向[83-86]数据表明，与结构RT程序的一部分相结合的潜在的肥大益处，尽管调查结果的实际影响仍然是可疑的;需要进一步研究以吸引更强的课题结论。对局部肌肉耐久性的载荷特异性效果的证据仍然是等因力的。早期工作表明，在肌肉耐力的肌肉耐力训练的潜在益处，特别是在绝对地测试时。也就是说，这种效果的证据相当弱，似乎与下半身肌肉组织更相关。或者，研究调查负载对相对肌肉耐力的影响是相互冲突的，并且在大多数情况下，似乎并没有支持从重复连续统计中汲取的建议。总体而言，在妇女上有一个缺乏研究的主题。鉴于妇女具有更大的抵抗疲劳能力的证据表明，可以想到，在重复的连续体内可能存在性别特异性差异。未来的研究应该努力在用不同装载方案训练时确定在力量，肥大和与耐力相关的结果中的性别二态性的潜力。其余参考部分可至原网站产看 点击查看：查看文章上部分内容更多有生物学文章更多医学分类文章使用文档翻译功能 免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网站无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。 来源于：mdpi
2021-04-07 19:08:38
上部分文章点击： NMR测量的焙烤时间对咖啡冲泡的感官和化学成分影响 （上
3.4. 感官和工具变量之间的相关性
使用分析软件LatentiX 2.12版（LatentiX，腓特烈堡，丹麦）进行多变量分析。使用完全交叉验证创建了基于NMR和GC-MS数据（X，自动缩放）和感官数据（Y）的偏最小二乘（PLS）模型，以研究感官属性与化合物之间的相关性。前两个分量足以解释85％的方差。大部分变化是由成分1（76％）解释的，该成分沿x轴产生了清晰的分离，如图2的Bi图所示。
“烘焙”和“快速”，对应于烘焙配置文件的极端值。 “慢”具有“烘焙”样本的特征，而“中”和“快速”具有细微差异，但相关性很高。
图2.具有NMR和GC-MS数据（x）和感觉数据（y）的PLS模型Bi图。
PLS模型清楚地分离了NMR和GC-MS数据，预测了分别表征“快速”和“烘焙”烘烤的感官属性。因此，发现了两组主要的化合物用于相应的两组感觉属性。这些列于表4。
表4.显影时间调制对咖啡样品的感官特征和化学特性的影响。所提供的化合物在给定的样品中占主导地位，在其他样品中也可能以较低的量发现。
更快的开发时间促进了更多的己醛，（E）-2-戊烯醛和苯乙醛，它们表现出绿色，苹果状，果味和花香味（thegoodscentscompany.com）。 Baggenstoss支持快速烘烤中醛类（如己醛）浓度的增加，J.等。 （2008年），其研究表明己醛的形成取决于焙烧过程中的高温。 NMR分析表明，“快速”烘烤中各种酸（苹果酸，柠檬酸和甲酸）的含量较高。总之，这些化合物可能有助于“快速”样品中酸度的感官知觉。 “快速”中2,3-丁二酮和2,3-戊二酮的含量较高，并且普遍认为它们具有类似黄油的香气。
绿原酸是生咖啡的主要成分[29]，并且在“快速”烘焙中被发现的程度更高。这些是奎宁酸和奎宁酸苦味化合物的重要前体，并随着烘烤度的增加而降解[25]。本研究表明，随着开发时间的延长，绿原酸5-CQA和3-CQA会持续降解，这很可能会增加“烘焙”烘烤的可感知苦味。
较长的开发时间有利于美拉德衍生的吡嗪具有较高的烘烤或坚果香气品质。这可能与“ Nutty + Chocolate”和“ Roasted”的感官描述符相关，在面板的“慢”和“烘焙”样本中它们被认为更强烈。一个例子是2.5-二甲基吡嗪，其典型特征在于具有烘烤或榛子样的香气。在其他研究中，已报道该化合物是咖啡特征香气的重要贡献者，此外，在慢速烘烤咖啡中还发现了这种化合物的浓度较高[30]。 “快速”烘烤中的曲古萘林也可能充当“烘烤”烘烤中发现的吡啶的前体，这得益于先前有关吡啶随烘烤持续时间连续增加的研究[12]。与本研究一致，以前曾提出将吡啶作为烘烤焙烧缺陷的标记[31]。吡啶和醇类（如2-甲基-1-丙醇，3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丁醇）在“烘焙”模式中占主导地位，并可以进一步促进杂种或烘烤香气。“烘焙”配置文件中的某些挥发物（例如3-甲基-3-丁烯-1-醇和3-己酮）可能仍会带来轻微的果味；然而，从感官分析来看，在强烈烘烤的美拉德衍生物的存在下，微妙的果味似乎被掩盖了。其他与开发时间无关的研究表明，与较快烘焙的咖啡相比，持续时间更长的低温烘焙产生的咖啡的顶空强度和酸度更低。重要的是要认识到，大多数挥发性化合物存在于所有样品中，而每种化合物的比例变化很大，从而导致咖啡的风味特征发生变化。与其他研究一致，每种化合物的重要性可能会因焙烧过程中的形成动力学而发生变化[32]。
具有较长显影时间的酸的降解与烘焙咖啡中酸度的降低相关。值得注意的是，所有酸似乎都被降解到相同程度，这意味着特定酸的比例不会因显影时间而改变。咖啡烘焙界的一种流行理论是，某些烘焙特征可能会偏爱特定的酸成分，从而使烘焙师能够突出显示特定的酸。这项研究的结果表明，开发时间不允许这种改变。这与其他作者的观点一致，即在不改变酸的相对组成的情况下，随着整体烘烤时间的延长，酸的减少[11]。
与特种咖啡行业的普遍看法相反，对冲泡的甜味不太可能是由于糖的存在。在咖啡样品之间发现甜味感官上的显着差异，但从NMR光谱中未发现可识别的单糖。如果存在糖，例如葡萄糖或果糖，浓度为1 mmol / L。糖的味觉识别阈值通常高于20 mmol / L [29]。此外，先前已显示出焙烧可将蔗糖急剧降解高达99％，这取决于焙烤特性[25,29,33]。还原糖是在烘烤过程中由长链碳水化合物的水解形成的，但可能会作为反应物迅速进入美拉德反应[33]。因此，考虑到咖啡物质的低浓度和复杂性会引起可能抑制甜味的其他感觉，因此碳水化合物不太可能在酿造的甜味感中起重要作用。
据推测，咖啡中的甜味感可能是由具有甜味食品和饮料特性的香气引起的，而不是由糖类带来的实际甜味。酮2,3-丁二酮（二乙酰基）和2,3-戊二酮均表现出令人愉悦的，黄油状的，焦糖状或奶油硬糖感[32,34,35]，并且在高浓度的样品中都具有较短的显影时间。尤其是，二乙酰基是甜品食品风味中广泛使用的化合物[35]，并且可以部分解释“快速和中等”感官小组发现的更高的甜度。 Schenker等。（2002）和Baggenstoss等。（2008年）发现，与慢速烘烤相比，快速烘烤的2，3-丁二酮和戊二酮浓度更高，尽管这些研究关注的是整体烘烤时间，而不是开发时间。发现这些化合物源自不同的糖片段，并且都显示出急剧的降解以及更长的烘烤时间[12]。此外，在焙烧过程中，即使在高温下，2,3-丁二酮也显示出稳定的作用[32]。因此，本研究中的降解可能是由于过度延长的烤制时间所致。表现出甜味的其他未知化合物也可能起作用。但是，它们尚未在咖啡中被识别。
3.5. 总体
考虑到样品之间烘烤程度的均匀性，烘烤时间的调节有助于整体风味的较大变化。由于样本大小和咖啡种类的多样性，数据的概括性自然受到限制。但是，本研究为咖啡焙烧的进一步研究奠定了坚实的基础，其实际应用的结果可帮助业界进行咖啡烘焙。由于将烘焙时间作为质量控制程序和产品开发过程中的过程参数，咖啡烘焙商可能会从中受益匪浅，因为结果表明，仅烘焙颜色不足以表明咖啡的化学和感官特性。因此，在评估咖啡烘烤一致性时，改进的质量控制过程应同时包括颜色读数和显影时间数据。此外，结果还支持在特种咖啡行业的认证计划中培训调节开发时间的技能的相关性。
开发时间的变化是正面还是负面是消费者研究的一个问题，应该由咖啡烘焙师针对的特定细分市场解决。此外，本研究未提供任何有关消费者检测咖啡的显影时间调制之间的风味差异的能力的信息。
该研究仅限于研究在Agtron 76±1的特定烘烤度下烘烤时间的影响。这些影响是否在不同烘烤度下持续存在是需要进一步研究的有趣领域。选择当前的烘烤程度是因为它被视为与商品烘烤中的“轻度烘烤”和特殊烘烤中的“暗度烘烤”相关。
4. 结论
本研究提供了新的证据基础，用于开发特定时间的烘烤曲线。在哥伦比亚咖啡豆的烘烤过程中调节显影时间对啤酒的化学成分和感官知觉有重大影响。快速烘烤有利于一种化学成分，该化学成分可在杯子中提供更高的果味，甜度和酸度感官感觉。较长的开发时间导致化学成分发生变化，从而提供了更多的烘烤，坚果+巧克力和苦味感官知觉。该研究结果支持在特种咖啡行业中开发多种咖啡风味的方法，以及将开发时间作为质量控制和产品开发参数的重要性。
附录A
感官评估中使用的描述符的详细信息。
表A1。烘焙咖啡感官评估中使用的描述符，定义和参考文献概述。
参考文献
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来源于：mdpi
2020-12-30 18:00:06
该图显示了各种多腔（双腔，四腔和八腔）腔的横截面图，其中所关注的共振模式具有轴突感应电场的预期分布。图片来源：Jeong等。 在过去的几十年中，许多实验物理学家一直在探索称为轴的粒子的存在，这是由他们认为可以解释理论和描述基本对称性的实验之间的矛盾的特定机制导致的。这种对称性与宇宙中物质与物质的不平衡有关，反映在不同粒子之间的相互作用中。如果这种机制发生在早期的宇宙中，那么这种粒子的质量可能很小并且是“不可见的。”随后，研究人员提出，轴突也可能是暗物质的一种有前途的候选者，暗物质是一种难以捉摸的，假设的物质，不发射，反射或吸收光。虽然尚未通过实验观察到暗物质，但据信它占宇宙质量的85％。检测轴突可能对正在进行的暗物质实验具有重要意义，因为它可以增强对这些难以捉摸的粒子的当前理解。基础科学研究所（IBS）的研究人员最近使用他们设计的多腔体腔镜（即观察光环，视差和其他类似物理现象的仪器）对隐形轴突暗物质进行了搜索。他们的结果与以前的基于悬臂式的轴距暗物质搜索相比，具有优势，突出了他们为暗物质搜索和其他物理学研究创建的仪器的潜力。进行这项研究的研究人员之一SungWoo Youn对Phys.org表示：“轴突可以以微波光子的形式检测到，并在强磁场存在下被转化为轴突。” “通常使用放置在螺线管中的圆柱形谐振器来利用谐振来增强信号的腔内窥镜是探究公认的理论模型的最灵敏方法。”尽管腔体检波镜可能是检测轴突的有前途的工具，但它们通常对相对较低的频率非常敏感。这主要是因为谐振频率与腔体半径成反比，从而减小了高频搜索的检测量。这就是为什么迄今为止进行的最敏感的轴突搜索（即华盛顿大学的轴突暗物质实验（ADMC））将实验极限设置在1GHz以下的原因之一。避免这种体积损失的一种可能方法是将许多较小的腔捆绑在一起并组合单个信号，以确保所有频率和相位都同步。尤恩说：“这种多腔系统早已提出，但由于影响系统操作的可靠性和复杂性而未能成功解决。” “由我本人领导的IBS轴力与精确物理研究中心（CAPP）的团队由我本人领导，位于韩国韩国科学技术高等研究院（KAIST），因此开发了一种新颖的腔体设计，细胞腔。”由扬和他的同事设计的腔体检眼镜的特点是有多个隔板，可将腔体的体积垂直地分成相同的单元。这种独特的设计以最小的体积损耗提高了谐振频率。研究人员还确保位于空腔中央的隔板之间被间隙隔开。尤恩解释说：“通过使所有单元在空间上相连，我们的设计使单个天线可以从整个空间拾取信号，从而大大简化了接收器链的结构。” “最佳尺寸的间隙还允许轴突感应的信号均匀地分布在整个空间上，无论腔体构造中的加工公差和机械失误如何，最大化有效容积。我将这种腔体设计称为“比萨腔”，并将间隙与比萨饼保护器，可以使切片保持其原始馅料的完整性。”研究人员用来进行实验的天文望远镜是基于模拟的大约两年研究的结果，然后制造了许多原型。在他们最近的研究中，它被用来利用9T超导磁体在2开尔文（-271°C）的温度下搜索轴突暗物质。这使研究人员能够快速扫描3 GHz以上200 MHz以上的频率范围，这是ADMX实验所覆盖范围的4到5倍。尤恩说：“即使我们还没有观察到任何类似轴突的信号，我们也成功地证明了多细胞腔体能够以高性能和可靠性检测高频信号。” “我们还计算出，由于更大的体积和更高的效率，这种新的腔设计可使我们探索给定频率范围的速度比传统频率快4倍。我经常做出幽默而有意义的陈述：探索某物需要4年，我们的实验仅需1年。我们的博士学位 学生可以比其他人更快地毕业。”尤恩和他的同事进行的研究证明了他们开发的比萨腔式天文望远镜的价值和潜力，这些天文望远镜可用于在高频区域进行隐形暗物质搜索。因此，将来它可以帮助寻找这种难以捉摸的物质，甚至有一天甚至可以对其进行检测。Youn补充说：“目前，我们的中心还在通过将几个比萨饼腔嫁接到现有系统上以寻找更高频率的轴心进行实验的准备。” 更多物理学文章免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网站无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。来源于：PHYS
2020-12-29 18:04:30
焙烤时间对咖啡冲泡的特征、化学影响及DHS等（下和DHS-GC-MSJesper Alstrup1，*，Mikael Agerlin Petersen 2，Flemming Hofmann Larsen 2和MortenMünchow11. CoffeeMind，Hansstedvej 35，丹麦Valby2500；morten@coffee-mind.com2. 哥本哈根大学理学院食品科学系，Rolighedsvej 26，1958年，丹麦腓特烈斯贝格C；3. map@food.ku.dk（硕士）; qcpmg1968@gmail.com（F.H.L.） * 通讯：jesper@coffee-mind.com 收到：2020年10月19日;接受：2020年12月1日;发布时间：2020年12月3日 摘要：特种咖啡行业正在发展，因此，人们对调制烘焙配置文件以向客户提供新的和多样化的感官体验的兴趣日益浓厚。本研究调查了咖啡烘焙过程“开发时间”阶段中细微变化的化学和感官效果。通过感觉描述分析（DA），气相色谱-质谱（GC-MS）和核磁共振（NMR）研究了四种烘烤曲线。多变量分析显示DA，GC-MS和NMR数据的清晰分离。延长的开发时间促进了咖啡化学和感官特性的统计上显着变化。研究结果表明，较短的显影时间可增加咖啡的果味，甜味和酸性特征，而较长的显影时间则会使咖啡的平衡朝着更加烘烤，坚果和苦的方向发展。结果提供了支持微妙的烘烤轮廓调制效果的证据。这为将开发时间作为关键控制参数纳入特种咖啡协会的认证系统，质量控制和产品开发策略奠定了坚实的基础。 关键词：咖啡烘焙；特色咖啡；烘烤概况开发时间;咖啡化学；感官评估1. 介绍 在过去的几年中，对特色咖啡的兴趣一直在稳定增长，一些较小的咖啡馆和咖啡烘焙店正在进入市场[1]。越来越多的知名度导致人们专注于在生产链的每个步骤（包括烘烤过程）中优化质量。咖啡豆的烘焙对于赋予最重要的风味特征至关重要，这是复杂的化学反应和咖啡豆物理结构变化的结果[2]。烘焙配置文件设计中注重细节是开发多样化和独特感官体验的必要条件，这在特种咖啡市场中是非常需要的[3]。烘焙过程中存在无限的可能性，并且烘焙的各种时间-温度关系可能会导致咖啡冲泡的最终风味发生明显变化。该行业当前的趋势是围绕咖啡的轻烤，以突显咖啡固有的感官特性，例如风土。这自然会降低对烤制程度的注意力，并将焦点转移到其他变量，例如在不同阶段以最佳方式对过程进行计时。烤制轮廓设计中最基本的概念之一是“开发时间”，即重要性。 其中已经在作者的先前工作中显示[4]。此阶段的定义是从“第一裂纹”处的豆子释放蒸汽压力的爆裂声到烘烤终止点的时间跨度。由于烘焙过程中释放出蒸汽，因此咖啡豆材料在烘烤过程的这一阶段特别容易受热。这会使豆类材料变干，从而使褐变反应发生得更快，从豆类材料的表面移动到中心[5]。因此，控制烘烤过程的这一阶段成为开发优质品尝产品的关键部分。但是，这一概念在学术文献中仍然被忽略。自称的烘焙专家教授了有关各种时间调整的风味影响的几种理论，并为社区所普遍接受。仍需要建立足够的证据基础，以为行业内的专业人员和教育系统提供支持。化学反应动力学的基本规则是，较高的温度会增加反应速率[6]，这是焙烧炉用来控制焙烧过程的原理。通过变化的时间-温度关系可以达到相似的烘烤度，但是，据作者所知，以前没有研究隔离出特定相位调制的影响，例如显影时间。典型的烘焙研究已经研究了在烘焙过程中应用不同的设定时间-温度关系来改变杯子中的化学成分和潜在风味的效果[7-11]。以y温度指定x时间的等温条件的方法可以实现一种清晰而系统的样品开发方法，但可能会冒着过度简化烘焙过程的风险，这与特种咖啡烘焙机的实际工作相去甚远。通常，烘焙主从接近燃烧器（热源）的最大功率输出开始烘焙，然后逐步降低功率输出，以随着烘焙的进行减慢褐变反应的速度。研究方法和焙烧炉实际工作之间的巨大分歧可能会降低科学研究在适用于特种咖啡焙烧炉工作方面的相关性。因此，本研究专门针对开发时间调制，与整体开发相比，调制时间似乎对风味开发具有更高的影响烘烤时间[4]。本研究旨在通过调查调制“烘烤时间”如何影响咖啡冲泡的感官特征和化学成分来研究特种咖啡行业及其实践，如通过核磁共振（NMR）和动态顶空进样与气体结合测量色谱-质谱（DHS-GC-MS）。关于精细调制的影响的知识，就化学化合物的形成以及饮料的感知风味的变化而言，是特种咖啡行业的主要兴趣所在。这项研究需要提供证据，以使烘焙师对其工艺具有必要的信心，并为特种咖啡行业的产品开发，质量控制程序和教育系统提供坚实的研究基础。2. 材料和方法2.1. 咖啡样品制备CoffeeMind Aps通过Kontra Coffee A /S 提供了未经烘焙的生咖啡样品。这些豆类来自哥伦比亚（Juan Guillermo Henao，Marsella），100％阿拉伯咖啡，并通过“水洗”方法进行了加工。生长高度在海拔1200–1800 m处，并且豆类的水分含量为10％，密度为880 g / L（SINAR 6070 Grainpro），并且豆类的筛网尺寸为17。在Probat Probatino上进行样品烘烤（Probat-Werke，莱茵河畔的Emmerich，德国）1公斤鼓式烘烤机。使用Cropster©焙烧软件（Cropster®，萨克拉门托，CA，美国）同时记录焙烧概况数据。使用Javalytics在Agtron中测量最终的烘烤颜色®模型JAV-RDA-D（麦迪逊仪器公司，美国威斯康星州米德尔顿）进行了三次精细复制研磨咖啡。烘焙配置文件专门针对“开发时间”调制，即从“第一次破解”到烘焙终止的不同烘焙速度。烘烤的初始阶段，直至出现第一个裂纹,并且所有样品的烘烤度在所有烘烤之间都相似，因此将“显影时间”隔离为轮廓之间的唯一差异。 图1说明了四个烘烤曲线的时间-温度关系。第一次烘烤大约在570 s发生。超过此点的曲线斜率是本研究和烤制轮廓开发的重点。因此，调制的确很细微，尽管第一次破裂后的烘烤时间差异很大，但烤豆在外观上看起来是相同的。这四个曲线表示在给定的烘烤度下，从最快到最慢的潜在开发时间调制的频谱。图1.研究中包括的烘烤曲线。该图说明了“快速”，“中等”，“缓慢”和“烘焙”的时间-温度条件。第一次烘烤大约在570 s时出现。 可以用多种方法来定义烘烤程度，包括减少豆的重量，颜色或选择的化学指示剂[12-15]。这项研究测量了最终豆色所指示的烘烤程度，以说明各种时间-温度关系。本研究选择Agtron 76±1的“中等”烘烤度。烘烤之间的颜色偏差被最小化，因为先前已经证明烘烤颜色对风味有显着影响[16]。偏差为1，这对应于Javalytics®颜色分析仪的固有变化。尽管烘烤持续时间有很大差异，但仍需调整每个烘烤的最终温度，以保持相同的烘烤程度。先前其他作者已经描述了烤色显影的详细动力学[17]。对于本研究，快速烘烤在204.1°C下结束，中度在201.2°C下结束，慢速在198.4°C下结束并在191.1°C烘烤。在进行感官评估之前一周，就生产了烘焙咖啡样品。指的是特定样品的显影时间，这些样品分别命名为Fast，Medium，Slow和Baked。 “烘焙”是指咖啡中常见的一种烘焙缺陷，即第一次破裂后的时间急剧延长，温度几乎没有升高甚至没有升高[16]。开发时间的范围从“快速”配置文件中的90到“烘焙”配置文件中的390 s。中度和慢速烘烤的开发时间分别为143和266 s。 2.2. 感官评估 2.2.1. 酿造同时冲泡这四个咖啡样品，以确保饮料温度相似。冲泡程序遵循美国特种咖啡协会（SCAA）的标准，即在95℃下将5.5 g咖啡加100mL水[18]。咖啡在1.5升隔热的Bodum®Steel法国压力机（Bodum®，Triengen，瑞士）中调制，然后分装在杯子中，以确保在感官评估中三个重复样本之间具有相似性。同时将所有需要的咖啡研磨并混合，以防止对单个份量的潜在缺陷豆产生任何影响。总共向法国压榨机中添加了75克（±0.5克）研磨咖啡，以及1350克（±5克）95℃的水。将啤酒浸泡3:30分钟，然后将其搅拌10次，脱脂，最后，在4:00分钟按下柱塞。然后将冲泡的啤酒转移到热水瓶中，然后倒入评估表上的三位数编码杯子中。当咖啡冷却至55℃时就开始了评估，尽管消费者倾向于将消耗温度提高到60℃以上[19,20]。从较低的温度开始降低了烫伤的风险，并且已被证明可以在较高的温度下在微妙的风味和强烈冲击的烧烤风味之间提供更好的平衡[21]。2.2.2. 小组评估在奥斯陆举行的2017年北欧焙烧炉论坛上，招募了46位经验丰富的咖啡品尝师作为参与者。按照良好的感官规范[22]进行描述性感官分析，以评估预定义描述符的强度。这些是根据CoffeeMindAps未发布的结果以及咖啡专业人士熟悉的一般熟悉的概念选择的。评估票包括甜度，酸度，苦味，身体，涩味，烤，坚果+巧克力，水果+浆果和清洁杯。进行了简短的校准会议，以使基本口味，口感和香气的概念保持一致。向参与者介绍了每个描述符和参考资料的定义，以促进评估人员之间通用的词汇表和描述符的理解。有关详细信息，请参阅附录A。尽管参与者以前曾有过评估表的经验，但还是简要介绍了15分制量表的使用。参与者不知情，只给出了有关如何进行评估的必要信息。评估是以传统的“杯形”形式进行的，评估人员将少量给定的样品放在杯形勺子上，迅速将咖啡制成浆状以充气，最后在评估表上注明感知到的风味。将评估者分为六组，并为每组建立拔罐表，将所有3位数字编码的样本一式三份。测试现场被隔离，以防止来自准备区域的干扰并确保参与者的视线。提供去皮黄瓜，白色吐司面包和室温水形式的味觉清洁剂。评估表是通过数字方式创建的，以使评估者可以通过其智能手机执行评估。说明包括按照个人随机分配的顺序，不与其他小组成员互动，使用上颚清洁剂，并且仅用拔罐勺中的2–3口品尝每个杯子一次。感官数据的统计分析是在RStudio V1.1.463和PanelCheck V1.4.2中进行的。进行了方差分析（ANOVA），以调查样品之间感官属性的显着差异。进行了Tukey的事后测试，以调查其中哪些样本之间存在显着差异。2.2.3.核磁共振方法通过将250µL咖啡冲泡液与250 µL磷酸盐缓冲液（离子强度200mM； pH 3.55）和55µL含D2O的溶液混合，在5mm（外径）NMR管中制备用于NMR分析的样品。5.8毫米TSP-d4。根据第2.2.1节中所述的方案制备咖啡冲泡剂。核磁共振分析是使用Bruker AvanceDRX 500（11.7T）光谱仪（德国莱茵施泰滕）在Larmor频率为500.13MHz的条件下运行1H，采用双调谐反向检测BBI探针进行的。使用zgcppr脉冲序列[23]在298K下进行一维1HNMR实验。对于每个样品，使用5s的循环延迟，10,000 Hz的光谱宽度和1.63s的采集时间记录一次由128次扫描组成的测量。所有光谱均以0.0 ppm的TSP-d4参比1小时。所有1DNMR光谱均在Topspin4.0中进行处理。使用内部Matlab（版本8.3.0.532，美国马萨诸塞州内蒂克市的MathWorks®）程序以及先前对咖啡的研究发现的结果，确定各种分析物的浓度[24,25]。2.4. 动态顶空采样和GC-MS方法按照第2.2.1节中所述的方法制备咖啡，并在冲泡机上进行动态顶空采样（DHS）。对冲煮的咖啡而不是干燥的咖啡进行香气采样是为了提高DHS-GC-MS和感官评估结果比较的有效性。进行了DHS的三个重复。将20 mL准备好的咖啡转移到100 mL气体洗涤瓶中，然后加入1 mL 4-甲基-1-戊醇的5 ppm水溶液作为内标。将烧瓶放在37℃的循环水浴中，并在磁力搅拌（200 rpm）下用氮气（100 mL min-1）吹扫20分钟。在含有200 mg Tenax-TA（网眼大小为60/80，Markes International，Llantrisant，英国）的阱中收集挥发物。吹扫后，用干燥的氮气流（100 mL min-1持续10 min）从阱中除去水。使用自动热脱附装置（TurboMatrix 350，Perkin Elmer，Shelton，CT，USA）使捕获的挥发物脱附。通过将捕集阱加热至250℃，并用载气流（50 mL min-1）进行15.0min进行初步脱附。汽提的挥发物被捕集在Tenax TA冷阱（30 mg，保持在5℃）中，然后在300℃加热4分钟（二次解吸，出口分配比为1:10）。这样就可以通过加热（225°C）将挥发物快速转移到GC-MS（7890A GC与带有三轴检测器的5975C VL MSD接口的三轴检测器，来自安捷伦科技公司，帕洛阿尔托，美国加利福尼亚州圣塔克拉拉）线。挥发物的分离在ZB-Wax毛细管柱上进行（长30 m，内径0.25 mm，膜厚0.50 µm）。使用氢气作为载气，色谱柱压力保持恒定在2.3 psi，导致初始流速为1.4 mL min-1。柱温程序为：30℃下10分钟，8℃min-1下从30℃到240℃，最后在240℃下5分钟。质量光谱仪在70 eV的电子电离模式下运行。扫描了15到300之间的质荷比。使用基于PARAFAC2的软件PARADISe（哥本哈根大学，哥本哈根，丹麦）从色谱图中提取峰面积和质谱，并使用NIST05数据库鉴定质谱。峰面积除以内标物的面积用作浓度的相对量度。通过与真实参考化合物的保留指数（RI）或文献中报道的保留指数进行比较，可以确认挥发性化合物的鉴定。DHS-GC-MS数据的统计分析在JMP14.0.0（美国北卡罗来纳州卡里的SAS Institute Inc.）中进行。对确定的峰进行单向方差分析，以研究化合物在样品之间是否存在显着差异。进行了Tukey的事后测试，以调查其中哪些样本之间存在显着差异。3. 结果3.1. 感官评估总共完成了46次完全答复。表1列出了每个描述符的平均强度等级，ANOVAp值和Tukey的测试结果。评估结果显示，开发时间对除Body之外的每个描述符具有统计学上显着（p <0.001）的影响。表1.每个描述符和样本的平均感官评估得分概述。 方差分析假定值报告在右栏中。 图基的事后分析的结果以字母表示。不同的字母表示样品之间的显着差异。 “快速”样本的“酸度”，“水果+浆果”和“清洁杯”属性在统计上得分高得多。从统计学上讲，“慢”和“烘焙”的开发时间越长，其对涩味，苦味，坚果+巧克力和烤味的认识就越明显。发现在较短的开发时间内，甜度最高。考虑到细微的调制和相同的烘烤度，差异是巨大的。 在几个描述子之间观察到高度的协方差，表明通过调节烘烤过程中的显影时间对风味产生一维影响。应该质疑专家组是否能够区分看起来高度相关的某些描述符，即逻辑错误[26]，或者属性是否确实以相同的方式进行调制。但是，这些效果在某种程度上是可以预料的，因为烘烤曲线的显影时间调制自然是一维参数。正如特种咖啡行业中普遍认为的那样，身体似乎不会随开发时间而变化。身体是专业人士描述咖啡的感官印象时使用的核心概念之一，特别是在烘烤轮廓方面。本研究定义了身体的概念，并提供了参考资料（附录A）以促进参与者的词汇发展和校准，但在评估中未发现差异。长期以来，人们一直推测身体如何通过烘烤曲线进行调制[27]，但是目前的发现表明，发育时间对调制感官属性没有影响。尽管在面板上为词汇发展做出了努力，但描述符的难解性很可能导致难以找到显着差异。如CoffeeMind的内部研究所表明的那样，个人对身体的理解在行业中很普遍，这会导致感觉评估上的复杂性。缺乏对齐方式有望反映为数据的不一致性，这在其他描述符中也已发现[28]。当前特种咖啡的趋势强调了咖啡中高水平的酸度和果味的发展，这受到“快速”烘焙的青睐。有趣的是，由于从咖啡豆表面到中心的焙烧程度在理论上更为明显，因此传统上将极快的焙烧视为焙烧缺陷。相比之下，烤制烤制似乎具有类似于深色烤制的特征。这些通常会增加苦味，伴有烤焦甚至烧焦的味道[7]。3.2. 核磁共振NMR研究表明，咖啡调制的化学成分发生了实质性变化，这是由于调制了烘烤时间造成的。在四个样品中鉴定出十二种不同的化合物。鉴定出的化合物存在于所有四个样品中，但浓度存在显着差异。表2列出了四种咖啡样品中鉴定出的化合物及其变化。通常，“快速”分析物的总浓度较高在“烘焙”中最低，最低。鉴定出的酸显示浓度普遍下降，且显影时间延长。 表2.在通过不同焙烧曲线制备的咖啡样品的1H NMR光谱中观察到的分析物浓度（mM，不确定度+/- 0.02mM）。在NMR光谱中未发现碳水化合物，这是由于在其他化合物的3-6ppm光谱区域中出现了非常强烈的峰。检查光谱范围为4.3-5.5 ppm（碳水化合物中的异头质子的峰的区域）中未分配的峰，得出的结论是，任何碳水化合物的浓度均低于0.5 mM。3.3. DHS-GC–MS通过动态顶空进样与气相色谱-质谱联用（DHS-GC-MS）来测量显影时间调制对香气化合物的影响。从色谱图中可以提取质谱图和146个峰的面积。初步方差分析（ANOVA）表明，咖啡样品中的49个峰的水平存在明显差异，其中39个峰的保留指数可确认其同一性。表3汇总了这些化合物。其他主要气味可以识别出多少咖啡，但由于样品之间的差异不大，因此未包含在表格中。因此，该表仅包括有关特定显影时间调制的目标香气。 “快速”和“烘焙”样品的化学成分差异最大，而“中等”和“慢速”样品之间的差异很小。通常，更快的烘烤到达较高温度的顶部空间中的挥发物含量更高，这与作者将咖啡豆置于等温条件下一致[17]。下一节将更深入地描述这些差异。 表3.在动态顶空进样（DHS）-GC-MS分析中鉴定出的化合物的选择。表格中仅包含样品之间的平均相对峰面积有明显变化的化合物。Tukey事后分析的结果以字母表示。不同的字母表示样品之间的显着差异。（1）图书馆价值来自2019年Bethesda国立卫生研究院PubChem。 3.4. 感官和工具变量之间的相关性使用分析软件LatentiX 2.12版（LatentiX，腓特烈堡，丹麦）进行多变量分析。使用完全交叉验证创建了基于NMR和GC-MS数据（X，自动缩放）和感官数据（Y）的偏最小二乘（PLS）模型，以研究感官属性与化合物之间的相关性。前两个分量足以解释85％的方差。大部分变化是由成分1（76％）解释的，该成分沿x轴产生了清晰的分离，如图2的Bi图所示。“烘焙”和“快速”，对应于烘焙配置文件的极端值。 “慢”具有“烘焙”样本的特征，而“中”和“快速”具有细微差异，但相关性很高。 免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网站无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。来源于：MDPI
2020-12-28 18:06:18
具有脂质特异性寡克隆IgM谱带特征的患者外周血单个核细胞的全转录组分析揭示了两个环状RNA和两个线性RNA作为高活性疾病的生物标志物
患者核细胞揭示环状线性RNA高活性疾病生物标志物（结论）
Leire Iparraguirre1，Danel Olaverri 1,2，Telmo Blasco 1,2，LucíaSepúlveda1,3，
塔玛拉·卡斯蒂略（TamaraCastillo-Triviño）4，梅赛德斯·埃斯皮尼诺（MercedesEspiño）5，露西恩·科斯塔·弗罗萨（Lucienne Costa-Frossard）5，阿尔瓦罗·普拉达（ÁlvaroPr ada）6，路易莎·玛丽亚·比利亚（LuisaMaríaVillar 3.5），大卫·奥塔吉（David Otaegui）1.3和梅德·穆尼奥斯·库拉（MaiderMuñoz-Culla）1.3
1 Biodonostia健康研究所神经科学领域的多发性硬化症小组
20014西班牙圣塞瓦斯蒂安； leire.iparraguirre@biodonostia.org（L.I.）; a904612@alumni.unav.es（D.O.）; tblasco@tecnun.es（TB。）; lucia.sepulveda@biodonostia.org（L.S.）; david.otaegui@biodonostia.org（D.O.）
2 Navarra Tecnun-Universidad生物医学工程与科学系，
Manuel deLardizábal15，20018西班牙圣塞瓦斯蒂安
3 西班牙多发性硬化症网络，西班牙巴塞罗那08028； luisamaria.villar@salud.madrid.org
4 巴斯克卫生局神经病学系生物dondonia健康研究所神经科学区多发性硬化小组，西班牙圣塞瓦斯蒂安，20014； TAMARA.CASTILLOTRIVINO@osakidetza.eus
5 西班牙马德里28034拉蒙·卡哈尔医院（IRYCIS）多发性硬化病科免疫学和神经病学系； mercedes.espino@salud.madrid.org（M.E.）; lucienne.costa@salud.madrid.org（L.C.-F.）
6 巴斯克卫生局免疫学系生物dondonia健康研究所神经科学领域多发性硬化小组，西班牙圣塞瓦斯蒂安，20014；
收到：2020年10月26日;接受：2020年11月23日;发布时间：2020年11月26日
摘要：抗髓磷脂脂质特异性寡克隆IgM带（LS-OCMBs）的存在已被定义为多发性硬化症侵袭性进化的准确预测指标。但是，这种生物标记物的检测是在脑脊液中进行的，这是一种侵入性很强的液体活检。在本研究中，我们旨在研究具有脂质特异性寡克隆IgM谱带特征的患者的外周血单核细胞（PBMC）中miRNA，snoRNA，circRNA和linearRNA的表达情况。我们纳入了总共89名MS患者，其中47名LS-OCMB状态为阴性，而42名为阳性状态。在发现队列中使用微阵列芯片（miRNA和snoRNA）和RNA-seq（环形和线性RNA）来进行分析研究，并通过RT-qPCR在整个队列中验证了候选对象。候选者的生物标志物潜力通过ROC曲线分析进行评估。 RNA-seq和RT-qPCR验证显示，在LS-OCMBs阳性患者的PBMC中，两个环状RNA（hsa_circ_0000478和hsa_circ_0116639）和两个线性RNA（IRF5和MTRNR2L8）被下调。最后，这些RNA在某些组合中显示出70％的准确度。 hsa_circ_0000478，hsa_circ_0116639，IRF5和MTRNR2L8的表达可能是高度活跃疾病的微创生物标志物。
关键词：多发性硬化；生物标志物转录组微小RNA;环状RNA；寡克隆带
1. 介绍
多发性硬化症（MS）是中枢神经系统（CNS）的一种慢性，炎性，神经变性和脱髓鞘疾病。它被认为是一种自身免疫性疾病，其中外周自身反应性淋巴细胞进入中枢神经系统并产生免疫反应，导致白质和灰质的脱髓鞘性病变[1]。据估计，大约有2到300万人患有MS，它通常会影响20至40岁的年轻人。此外，MS在女性中的流行率是男性的三倍，并且有证据表明该比率在最近70年中有所增加[1]，这是与其他几种自身免疫性疾病共有的现象。
MS的病程和临床表型在患者之间以及同一个人中随时间变化都很大。因此，生物标记物可以帮助诊断，MS表型的分化以及监测疾病的进展[2,3]。
疾病活动性生物标志物可以与疾病的不同病理生理过程相关，并且理想地可以帮助区分具有侵袭性病程的患者和具有良性病状的患者[2]。在这种情况下，抗髓磷脂脂质特异性寡克隆IgM带（LS-OCMBs）限于脑脊液（CSF）的存在已被定义为侵袭性进化的准确预测因子[4]。然而，对于该测试，需要脑脊液样本，这是一种侵入性很强的液体活检。因此，为发现微创生物标志物，例如血液生物标志物，已经付出了巨大的努力[5]。
在这种情况下，基因表达谱研究已被广泛用于新的生物标志物发现，但也阐明了疾病中致病过程的分子机制[6,7]。除了经典的蛋白质编码转录组以外，非编码转录组在过去几十年中也引起了人们的极大兴趣，包括我们小组在内的几位作者都证明了它在MS发病机理中的作用[8-10]。 MicroRNA是研究最好的非编码小RNA类型，尽管其他诸如小核仁RNA也与MS相关[11,12]。 MiRNA是单链小的非编码RNA，它们在转录后水平上调节基因表达，并与目标mRNA结合，并且它们参与几乎所有已知的生物学过程[13]。最近，环状RNA（circRNA）作为RNA领域的新参与者出现，在转录后调控机制中起着重要作用。人们发现它们参与了多个过程，例如肿瘤，代谢和免疫相关途径，因此，它们还与多种疾病（如神经系统疾病和自身免疫性疾病）相关，包括在MS中的一些研究[14-18]。 miRNA和circRNA都被认为是广泛的样品类型，如血液，血清，唾液，尿液和CSF中生物标志物的有前途[19-21]。
鉴于这些证据，并且由于对MS固体，可复制和可及的生物标志物的需求不断增加，我们假设对具有LS-OCMBs特征的患者外周血单核细胞（PBMC）进行的全转录组研究可以揭示新的生物标志物与此稳定的CSF标记相关。这样的生物标记物可以更容易地用于持续监测患者，因为与腰穿相比，血液采样的侵入性较小，副作用较小。
考虑到这一点，在本研究中，我们分析了89例阳性（n = 42）和阴性（n = 47）患者外周血单个核细胞（PBMC）中小的非编码RNA，circRNA和线性RNA的表达。 LS-OCMBs表征，发现两个环状RNA和两个线性RNA，两组之间差异表达，可作为未来高度活跃疾病的血液生物标记。
2. 实验部分
2.1. 患者，样品收集和RNA分离
在征得知情同意后，在医院Ramon y Cajal招募了MS患者。按照标准的Ficol梯度分离方法，采集血样并分离PBMC并在液氮中冷冻直至使用。按照制造商的说明，使用miRNeasy mini试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）分离总RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计（ThermoFisher Scientific，Waltham，Massachusetts，MA，USA）测量RNA浓度，并使用Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies，Inc.）评估微阵列和RNA-seq实验中样品的质量。美国加利福尼亚州圣克拉拉市），在所有样品中获得的RNA完整性数均高于6。如前所述[4,22]，获得了CSF来分析LS-OCMB的状态。
表1总结了患者的主要临床和人口统计学特征。表S1列出了样品的完整列表以及包括每个样品的实验。该研究得到医院伦理委员会的批准（MMC-UEM-2018-01，2018年10月）。该分析队列仅包括女性样本，旨在减少变异的来源，并考虑到该疾病中女性的MS发病率是男性的三倍[1]。
表1.患者的临床和人口统计数据摘要。
*包括分析人群中的患者。年龄-平均（范围）。 LS-OCMB-脂质特异性寡克隆IgM带。 P-正。 N-负数。 F—女。男—男。我们没有年龄数据的验证队列中有7个主题（1个阳性和6个阴性）。
2.2. 芯片分析
使用FlashTag HSR生物素标记试剂盒（Genisphere LLC，Hatfield，Pennsylvania，PA，USA）标记总RNA（200 ng），并与GeneChipmiRNA 4.0 Array（Affymetrix，Santa Clara，CA，USA）杂交，覆盖2578， 2025年和1996年人类成熟的miRNA，pre-miRNA和snoRNA。标记的RNA与阵列杂交，在GeneChip Fluidics Station 450中洗涤并染色，并在GeneChip Scanner 7G（Affymetrix，美国加利福尼亚州圣克拉拉）中进行扫描。
微阵列数据分析是在Transcriptome Analysis Console 4.0软件（Affymetrix，美国加利福尼亚州圣克拉拉）中进行的，仅将RMA + DABG算法应用于人类探针集以进行标准化，检测和汇总。我们在具有正负LS-OCMBs的患者之间进行了经典的差异表达分析，考虑到差异表达那些探针集，这些探针集的p值低于0.01，而绝对倍数变化（FC）值高于或等于1.5。
2.3.RNAseq
在CD Genomics（Shirley，纽约，NY，美国）中进行了文库制备和下一代测序。在文库制备之前，再次使用Agilent 2100生物分析仪测量RNA样品的浓度和质量。标准化后，使用Ribo-ZerorRNA去除试剂盒从总RNA样品中去除rRNA，然后进行纯化和片段化步骤。要构建测序文库，需进行链特异性cDNA合成，将3j末端进行腺苷酸化，然后连接衔接子。对生成的库进行质量控制和标准化过程。配对末端测序是用Illumina HiSeq X Ten PE150（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）进行的。
这项研究中提供的数据（微阵列和RNA-seq实验的原始数据）可在GeneExpressionOmnibus（GEO）中以序列号GSE159036公开获得。
2.4. RNA-Seq数据中的CircRNA检测和定量
首先，检查测序质量，然后使用STAR版本2.5.4b（https://code.google。com /archive /）将读数映射到人类基因组（hg19，从UCSCGenome Browser [23]下载）。p / rna-star /）[24]或BWA版本0.7.17-1（http://maq.sourceforge.net）[25]。随后，通过CIRCexplorer2版本2.3.3（https：//circexplorer2.readthedocs。io/en/latest /）[26]和CIRI2版本2.0.5（https://sourceforge.net/projects/ciri/ ）[27]遵循作者的建议。此外，只有这两种算法支持的circRNA才被视为真正的circRNA，并用于后续分析中，该方法已在其他作者的文献中进行了描述[28]。 CircRNA的表达基于根据CIRI2定量分析的反向剪接连接。滤出低表达（读数总和<10）的circRNA后，使用DESeq2 1.28.1版（http：// www。bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）进行差异表达分析[ 29] R（版本3.6.3）的软件包（https：
//R-studio（版本1.0.136）（https://rstudio.com/）中的//www.r-project.org/），以差异形式考虑
表达的circRNA显示p值<0.05和倍数变化高于2。为了选择一组候选物用于验证目的，应用了两个附加过滤器：（1）BaseMean值大于5（BM> 5）和（ 2）删除任何样本中读取计数值为零的转录本。最后，我们选择了十个具有最高绝对倍数变化值的候选circRNA。
2.5. RNA-Seq数据中的线性RNA检测和定量
经过测序和质量控制后，使用Kallisto版本0.44.0[30]算法进行转录本伪比对，鉴定和定量。使用DESeq2软件包进行差异表达分析。在运行DESeq2算法之前，我们应用了具有最小读取次数（大于或等于10的读取次数之和）的过滤器，以删除低表达转录本。对于后续分析，由于检测到大量的转录本且我们的样本量较小，我们添加了一个过滤器，以仅保留最可靠的转录本（有关其读取计数）。因此，我们创建了一个检测过滤器，如下所示：（1）在两个组中都检测到了转录本-在每个组的3个样本中，至少有两个读数的转录本。 （2）成绩单仅在一组中检测到-转录本在阴性的4个样本中至少有两个读数组，但仅在阳性组中有1个样品（仅在阴性组中检测到），并且转录组在3个阳性组中具有至少两个读数，但在阴性组中只有1个读数（仅在阳性组中有）。用该检测过滤器选择的转录本被认为是一致的线性RNA。最后，差异表达的转录本被认为是那些显示p值<0.05和绝对倍数变化值大于2的转录本。为了进行验证，我们选择了十个具有最高绝对倍数变化值并具有指定基因名称的线性线性RNA。
图1总结了所有这些分析实验以及数据分析步骤，工具和过滤器。
2.6. cDNA合成和定量PCR
为了验证候选microRNA，使用TaqManTM Advanced miRNA cDNA合成试剂盒（Applied BiosystemsTM，Foster City，CA，USA）将总RNA（10 ng）反转录为cDNA。为了量化miRNA的表达，我们按照制造商的规程使用了TaqMan Advanced miRNA测定法和TaqMan Fast Advanced预混液（Applied BiosystemsTM，美国加利福尼亚州福斯特市）。 hsa-miR-191-5p的测定用作标准化目的的参考miRNA。
图1.研究摘要，指出分析实验，数据分析工具，过滤器和候选者选择标准。阳性。负数-负数。 DE-差异表达。 FC-倍数变化。 BM-BaseMean。 BSJ-背面接合点。 Padj-调整后的p值。 BWA-Burrows-Wheeler对准器。
为了验证候选circRNA，按照试剂盒操作规程，使用高容量cDNA反转录试剂盒（AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA），使用随机引物将总RNA（500 ng）逆转录为cDNA。使用10 ng cDNA作为模板并使用Power SYBRGreenMaster Mix（Applied BiosystemsTM Foster City，CA，USA）通过以下热循环程序建立PCR反应：温度为50℃持续2分钟，温度为95℃ 10分钟，在95℃持续15 s，在60℃进行1分钟的40个循环，然后进行解离曲线分析。如前所述[18]，使用了不同的引物，以使扩增子跨过反向剪接连接（BSJ）。 EEF1A1和B2M用作参考基因，使用两个基因的平均值进行标准化。熔解曲线中单峰的存在表明扩增的特异性。
为了验证候选线性RNA，按照制造商的规程，使用带有HiFlex缓冲液的miScript II RT（Qiagen，Hilden，德国）试剂盒，用oligo-dT和随机引物将总RNA（500 ng）反转录为cDNA。使用以下热循环程序，以10 ng cDNA为模板并使用miSscript SYBRGreenPCR试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）建立PCR反应：温度为95℃15分钟，40个循环为94℃15分钟s，55℃30 s和70℃30 s，然后进行解离曲线分析。使用QuantiTect引物分析（Qiagen，Hilden，德国）（表S2）进行每个线性RNA的扩增，并将B2M用作标准化的参考基因。熔解曲线中存在单峰表明扩增的特异性。
所有逆转录反应均在Veriti Thermal Cycler（美国加利福尼亚州福斯特城的Applied Biosytems公司进行）中进行，定量PCR反应在CFX384 Touch实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories，Inc.，大力神，加利福尼亚州，美国）。
在运行所有验证实验之前，对circRNA扩增进行了技术验证。随后，按照制造商的说明，使用ExoSAP-IT™PCR产品纯化试剂（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特市）纯化RT-qPCR扩增产物，并对Sanger测序（ABIprism3130）（Applied Biosystems，加利福尼亚州Foster City，美国）
为了检查BSJ的存在。另外，还对PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳以证实单个扩增产物的存在。
在CFX Maestro 1.0（Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）中分析了原始Cq值和熔解曲线。使用2ˆDDCq方法计算以倍数变化（FC）表示的表达水平。 R在RStudio中对DCq数据进行统计分析。数据分布通过Shapiro-Wilk检验进行了测试，分布差异通过学生t检验或非参数Wilcoxon秩和检验进行了评估。在每个circRNA和线性RNA数据集中，在进行统计分析之前先删除异常值样本，然后使用R中的boxplot.stat函数识别这些值。
2.7. 基因超表达测试
为了描述差异表达转录本的功能，基于基因本体论数据库的完整生物学过程（2019年12月9日发布），应用了PANTHER过度表达测试（2019年11月7日发布，Panther [31]）。作为参考背景，我们使用了产生上面定义的检测到的转录本的基因列表。进行Fisher检验，并将假发现率（FDR）校正应用于原始p值，将FDR值设置为低于0.05的显着阈值。
2.8. ROC曲线分析
基于RT-qPCR获得的DCq值，我们在RStudio中的R环境中执行了接收器工作特性曲线（ROC曲线）分析。使用了三个不同的数据集：（1）circRNA验证数据，（2）线性RNA验证数据和（3）两个数据集中的样本以测试转录本的不同组合。鉴于我们只需要包括没有任何缺失值的样本（表S1），因此最后一个数据集较小。用“ Epi”软件包的ROC功能计算出不同转录本的组合。
3. 结果
3.1. microRNA表达谱
微阵列分析能够检测出全部6659个人类探针组（42.45％）中的至少一个样品中的2827个探针组（图2A）。在检测到的探针组中，有33例显示LS-OCMBs阳性和阴性患者之间存在差异表达，更重要的是，显示最高表达的前10个探针组能够根据患者LS-OCMBs的状态对患者进行分组（图2B）。在这10个探针集中，我们可以找到五个成熟的miRNA，两个pre-miRNA和两个小核仁RNA。为了进行验证，我们选择了可以使用TaqMan Advanced miRNA分析的四个成熟miRNA（hsa-miR-6800-5p，hsa-miR-6821-5p，hsa-miR-4485和hsa-miR-4741）。但是，RT-qPCR验证结果并未确认这四个miRNA的改变（图2C）。
3.2. circRNA表达谱
环状转录组的RNA-seq分析流程检测到27,630个真正的circRNA和5431个circRNA（19.6％），总读数≥10（图3A）。差异表达分析显示，两组之间有124个circRNA发生了改变（p <0.05; FC> | 2 |），其中72个被上调，而52个被下调。
我们选择了十个候选circRNA，以在更大的队列中通过RT-qPCR确认它们的差异表达。首先，用于引物扩增的技术测试确认了10种circRNA候选物中有9种进行了单一且特异性的circRNA扩增。circMETRNL是一种在琼脂糖凝胶上未显示出良好扩增和单条带的抗体，因此我们在随后的验证实验中将其丢弃。此外，PCR产物的Sanger测序证实扩增子跨越BSJ（图S1）。如图3C所示，通过qPCR在LS-OCMB阳性患者的PBMC中证实了hsa_circ_0000478和hsa_circ_0116639的较低表达（分别为FC = -1.5和FC = -1.65； p <0.01）。
图2.微阵列表达的miRNA结果。 （A）热图显示了在至少一个样品中表达的miRNA的表达（微阵列强度信号）。 （B）显示最高表达的十个DEmiRNA的表达热图。分层聚类表明，这十个miRNA的表达模式能够根据患者的LS-OCMBs状态对其进行分组。 （C）选定候选miRNA的RT-qPCR验证结果。 P-LS-OCMB阳性。 N-LS-OCMB负状态。 DE-差异表达。
图3.通过RNA-seq进行的circRNA和线性RNA表达谱结果。 （A）火山图显示circRNA阳性和阴性组之间的表达差异（log2 FC），显示所有高于10的样品的读数总和.DEcircRNA以红色突出显示，并且标记那些DEcircRNA的碱基均值高于图5.（B）火山图显示了阳性和阴性组之间线性RNA的表达差异（log2 FC）。差异表达的线性RNA突出显示为红色，标记点的DE线性RNA的p值已调整
<0.01。（C）选定候选circRNA的RT-qPCR验证结果。星号表示统计学上的显着差异（p <0.01）。由于样品量的限制，circ_0000478和circ_0116639验证所包含的样品比其余circRNA多得多（表S1）。 （D）选定的候选线性RNA的RT-qPCR验证结果。星号表示差异具有统计学意义（p<0.05）。P：LS-OCMB的阳性状态。 N：LS-OCMB否定状态。
3.3. 线性成绩单表达谱
在本研究中，我们还通过RNA序列分析了线性转录组，鉴定出115,869个转录本，总读取次数≥10。我们使用检测标准应用了一个额外的过滤器，该过滤器可以识别出具有一致表达模式的84,863个线性RNA，从两组中均检测到92.8％。其中，有2441个转录物被差异表达（p<0.05和FC> | 2 |），两组均检测到1421个转录物（图3B）。其余的转录本是特定于一组的，仅在LS-OCMBs阴性患者的PBMC中表达382份，而在LS-OCMBs阳性的患者中表达638份。
我们选择了十个候选线性RNA来通过RT-qPCR确认它们的差异表达。
更大的队列。如图3D所示，在LS-OCMB阳性患者的PBMC中证实了IRF5和MTRNR2L8的较低表达（两个转录本中FC = -1.33； p <0.05）。差异表达的线性RNA主要在免疫系统的生物过程中富集。图4显示了最有意义和最丰富的术语（FDR<0.01和倍富集> 2）。补体激活，体液免疫应答和I型干扰素信号传导
路径出现在最丰富的术语中。
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来源于：mdpi
2020-12-18 18:58:14
具有脂质特异性寡克隆IgM谱带特征的患者外周血单个核细胞的全转录组分析揭示了两个环状RNA和两个线性RNA作为高活性疾病的生物标志物患者核细胞揭示环状线性RNA高活性疾病生物标志物（上）3.3. 线性成绩单表达谱在本研究中，我们还通过RNA序列分析了线性转录组，鉴定出115,869个转录本，总读取次数≥10。我们使用检测标准应用了一个额外的过滤器，该过滤器可以识别出具有一致表达模式的84,863个线性RNA，从两组中均检测到92.8％。其中，有2441个转录物被差异表达（p<0.05和FC> | 2 |），两组均检测到1421个转录物（图3B）。其余的转录本是特定于一组的，仅在LS-OCMBs阴性患者的PBMC中表达382份，而在LS-OCMBs阳性的患者中表达638份。我们选择了十个候选线性RNA来通过RT-qPCR确认它们的差异表达。更大的队列。如图3D所示，在LS-OCMB阳性患者的PBMC中证实了IRF5和MTRNR2L8的较低表达（两个转录本中FC = -1.33； p <0.05）。差异表达的线性RNA主要在免疫系统的生物过程中富集。图4显示了最有意义和最丰富的术语（FDR<0.01和倍富集> 2）。补体激活，体液免疫应答和I型干扰素信号传导路径出现在最丰富的术语中。 图4. 2441 DEmRNA的基因超表达测试结果。显示了最显着的（倍富集> 2）和富集的（FDR <0.01）GO生物过程。条形根据其FDR值进行着色。 DE-差异表达。 FDR-错误发现率。3.4. circRNA和线性RNA作为高度活跃疾病的生物标志物的评估为了评估四个经过验证的RNA作为LS-OCMB状态血液生物标志物的潜力，我们进行了ROC曲线分析。如表2所示，测试了不同的RNA组合以找到区分两组的最佳性能。我们发现，circRNA和线性RNA的不同组合可改善性能，达到约70％的AUC值。表2.四个候选成绩单和不同组合的ROC分析结果。ROC-接收机的工作特性。4. 讨论区在这项工作中，我们表征了具有明显LS-OCMB状态的MS患者的PBMC的整个转录组。该分析和验证实验表明，LS-OCMB阳性患者的PBMC的整体转录组与LS-OCMB阴性患者的PBMC的整体转录组不同。RNA-seq结果显示，两组之间有124个circRNA和2441个线性RNA差异表达。有趣的是，仅在一组中检测到58％的线性RNA，突显了来自具有不同LS-OCMB状态的患者的PBMC中存在特定的表达模式。是真的;但是，我们的RNA-seq样本数量有限，应谨慎对待这些观察结果。据我们所知，以前没有circRNA与MS相关。 Circ_0000478位于13号染色体，其宿主基因为von Willebrand因子A结构域，包含8个（VWA8）。有趣的是，该基因的线性转录本也是我们数据集中差异表达的线性RNA之一，其折叠变化为-3.23（p = 0.047）。最近已经描述了该转录本，并编码功能仍不确定的线粒体蛋白[32]。关于circ_0116639，它位于22号染色体上，与EP300基因重叠。 EP300是一种组蛋白乙酰转移酶，在我们的研究中被检测到但没有差异表达。 circRNA及其宿主基因表达模式的这些差异揭示了circRNA的生物发生与其宿主基因的生物发生是独立调控的，如先前所述[33]。值得注意的是，干扰素调节因子5（IRF5）是已确认的下调转录物之一，该基因的多态性与国际多发性硬化症遗传学联盟进行的最后一次全基因组关联分析中存在发展MS的风险有关。以及西班牙人群的复制研究[34,35]。此外，该基因中的SNP与CSF中CXCL13的水平增加有关，CSF是与高度活跃的疾病相关的趋化因子[36]。最重要的是，动物模型显示IRF5与小胶质细胞极化有关对中风和阿尔茨海默氏病有炎性反应（M1）[37,38]。正如其他作者在外显子组测序项目中所暗示的那样，这可能暗示了小胶质细胞在更积极的疾病过程中的意义[39]。尽管如此，我们的发现是在外周PBMC中进行的，因此IRF5来源可能是外周单核细胞或巨噬细胞。无论如何，需要进一步的研究来揭示IRF5在高度活跃的MS疾病病程中的意义。另一方面，MT-RNR2像8转录本（MTRNR2L8）是另一种经过验证的线性转录本，在LS-OCMB+组中表达较低，编码在11号染色体上，有趣的是，它跨越了miR-4485茎的位置环定位，是本研究中选择用于验证的四个miRNA之一。根据微阵列数据，miR-4485在MTRNR2L8中被下调在LS-OCMB +组中。 MTRNR2L8是mir-4485的宿主基因这一事实可能解释了，即使无法验证miRNA，这组患者的两个转录本也都被下调了。这些结果表明这两个RNA之间可能存在相互作用，可能与更活跃的疾病有关，但是需要进一步的研究来证实这一假设。根据UniProt的研究，MTRNR2L8具有神经保护和抗凋亡因子的作用，并且发现重度抑郁症患者在特定区域的大脑中MTRNR2L8的含量增加[40]。尽管该基因的功能尚不清楚，但对于MS而言，作为神经保护因子的可能作用非常有趣，因为我们发现该基因在PBMC中被下调。但是同样，应该进行进一步的研究以揭示外周血中MTRNR2L8表达与疾病活动以及这种关系的潜在机制之间的可能联系。基因过度表达测试表明，与补体激活，体液免疫反应和I型干扰素反应有关的生物学过程是最丰富的术语。值得注意的是，IgM抗体的鞘内合成以前与鞘内补体激活相关[41]，并且已经清楚地证明了其在脱髓鞘和轴突损伤中的作用[42]。有趣的是，补体系统的不同组成部分已与MS相关，某些组成部分的血浆水平已被提议作为MS疾病状态生物标志物[43]。值得注意的是，这些过程在具有高活性疾病标志物的患者的PBMC中的改变基因中富集。该分析可能表明这些患者的免疫反应可能改变，这可能解释了其较高的疾病活动性，但仍需要进一步和其他类型的研究来探索这一假设。这项研究的主要目的是鉴定血液中的一种或多种可以区分阳性和阴性LS-OCMB患者的生物标志物，从而可以用作高度活跃疾病的更容易获得的标志物。 ROC曲线分析显示，这些标记组合在一起具有大约70％的准确度，通常被认为是可以接受的性能[44]。考虑到这些都是在血液中测量的，它们可能有助于诊所进行重复测量，而连续采集CSF样品则存在严重缺陷。鉴于他们的有效治疗范围可能比较良性或较不活跃的疾病形式要窄，因此正在努力确定患有高度活跃疾病的患者[45]。与此相一致，已经提出了几种生物标记物来鉴定具有侵略性疾病进程的个体，例如神经丝轻链的CSF水平，CXCL13或CHI3L1 [46-48]。其他作者还报告了具有不同疾病活动的患者之间非编码转录组的差异。 Quintana及其同事研究了一组具有LS-OCMB特征的MS患者和其他神经系统疾病（OND）患者的miRNA在CSF中的表达[49]。他们发现OND组和LS-OCMB +组之间miR-30a-5p，miR-150，miR-645和miR-191的表达存在差异，但他们发现LS-OCB阳性和阴性患者之间没有任何差异OCMB。由于他们的研究与本研究之间的分析平台不同，我们无法检查来自Quintana及其同事的数据中候选miRNA的表达。另一项研究报道，miR-24-3p的血清水平与疾病进展指数相关，通过计算EDSS值除以疾病持续时间得出，但未测量LS-OCMB的状态[50]。最近，长非编码RNA在血液中的表达也被描述为显示根据年龄相关的MS严重程度评分，区分高活跃MS患者与其他病程较轻的患者的能力[51]。所有这些研究都突出了能够识别高活动性疾病患者的生物标志物的需求，以及科学界朝着这个方向所做的努力。此外，鉴于每项研究使用不同的参数来对各组患者进行测量和分类，因此对于什么是侵略性疾病过程的定义达成共识也很重要，这使得它们之间的比较确实具有挑战性[52 ，53]。该组患者的早期识别可以受益于不同的治疗建议，并且；因此，有可能改善疾病的长期结果。我们的miRNA分析研究发现了两组之间差异表达的miRNA，尽管尚未通过RT-qPCR实验验证。在这方面，其他技术（例如液滴数字PCR（ddPCR））可能有助于减少变异性并发现组之间的细微差异。尽管据报道在基因表达研究中使用ddPCR并不会增加灵敏度，并且只要起始物质的量足够多且反应中没有污染物，其性能是相似的[54,55]。尽管如此，在未来的验证项目中可以考虑使用该技术，该项目旨在明确丢弃或将那些miRNA用作生物标志物，以用于更具侵略性的MS疗程。5. 结论总之，我们已经鉴定出在LS-OCMB阳性患者中被下调的两个circRNA和两个线性RNA。我们的发现对于多发性硬化症的生物标志物领域非常重要，因为它们可以有助于识别高度活跃的疾病患者。此外，与其他生物标志物相比，一个重要的优势是可以在血液中检测到它们，从而可以进行连续检测来监测其水平，而腰椎穿刺不建议这样做。为了确定其效用，还需要在更大的人群中进行进一步的研究，但是我们认为，它们可以作为确定哪些患者应进行腰穿以确认其LS-OCMB状态的首选筛查工具。 补充材料：补充材料可以在http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/540/s1上找到。表S1：样品和实验的完整列表，其中包括每个样品。表S2：RT-qPCR实验中使用的测定和引物。图S1：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图像和Sanger测序结果显示circRNA的反向剪接。作者贡献：概念化，D.O。 （DavidOtaegui）和M.M.-C .；方法论（DavidOtaegui），M.M.-C.，L.I.，TB.D.O。（Danel Olaverri）和L.M.V .；验证和L.S .；形式分析，L.I.，D.O.（DanelOlaverri），TB，M.M.-C.，M.E。和L.C.-F .；调查，L.I.，M.M.-C.，M.E.，L.C.-F .；资源，A.P.，T.C.-T.，M.E.，L.C.F.，L.M.V。和D.O. （David Otaegui）；写作-原始草稿，L.I.，D.O。 （David Otaegui）和M.M.-C .；写作-审查和编辑（Danel Olaverri），TB。，Á.P.，TC.C.T.，L.M.V .；可视化，L.I.，D.O. （Danel Olaverri），M.M.-C .；监督，D.O.（DavidOtaegui），美国密西西比州立大学和L.M.V .;项目管理，做。 （David Otaegui）和M.M.-C .；资金收购，L.M.V.，D.O. （David Otaegui）和M.M.C.所有作者均已阅读并同意该手稿的发行版本。资金：这项研究由萨洛德·卡洛斯三世研究所（PI17 / 00189和PI15 /00513），西班牙红色硬化菌（REEM）（RD16/0015/0007和RD16/ 0015/0001），吉普斯夸省理事会（109）资助/ 18）和巴斯克政府（PRE_2019_2_0206）和ELKARTEK计划。致谢：作者要感谢Biodonostia Health Research Institute基因组平台的工作人员。利益冲突：作者声明没有利益冲突。资助者在研究的设计中没有作用。在数据的收集，分析或解释中；在手稿的撰写中，或在决定发表结果时。 参考文献（展示部分文献内容，查看全部可在原网站）1. 菲利皮，M .；Bar-Or，A。 Piehl，F .； Preziosa，P .; Solari，A .； Vukusic，S .；马萨诸塞州罗卡多发性硬化症。纳特版本号Dis。总理。 2018，4，1–27。[CrossRef] [PubMed]2. 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2020-11-18 19:00:00
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