Thapsigargin是主要人类呼吸道病毒的广谱抑制剂：冠状病毒，呼吸道合胞病毒和A型流感病毒

经过： 莎拉·贝塔吉（Sarah Al-Beltagi）克里斯蒂安·亚历山德鲁·普雷达利亚·古尔丁乔·詹姆斯Pu娟保罗·斯金纳江志敏王琳琳杨佳云阿什利C.肯尼斯·梅利兹帕维尔·格什科维奇（Pavel Gershkovich） 6，克里斯托弗·J·海斯乔纳森·阮·范·塔姆伊恩·布朗刘金华和张建洲

1.诺丁汉大学动物医学与科学学院，萨顿·博宁顿，诺丁汉LE12 5RD，英国

2.英国沃金GU24 0NF，Pirbright，Ash Road，Pirbright学院

3.英国Addlestone KT15 3NB，Woodham Lane的Weybridge，动植物卫生局（APHA）

4.中国农业大学动物医学院，农业部动物流行病学重点实验室，北京圆明园西路2号，北京100193

5.英国诺丁汉萨顿博宁顿诺丁汉大学生物科学学院，LE12 5RD，英国

6.英国诺丁汉大学公园诺丁汉大学药学院NG7 2RD，英国

7.英国诺丁汉大学公园诺丁汉大学化学学院NG7 2RD，英国

8.英国诺丁汉大学公园诺丁汉大学医学院NG7 2RD

*应与之联系的作者。

这些作者为这项工作做出了同等的贡献。

摘要：SARS-CoV-2和其他主要呼吸道病毒的长期控制策略除了明智使用有效疫苗外，还需要包括抗病毒药以治疗急性感染。虽然正在为大规模疫苗接种推出COVID-19疫苗，但针对任何疾病使用或开发的适量抗病毒药物证明了抗病毒开发的挑战。我们最近发现，无毒的毒胡萝卜素（TG）是肌腱蛋白/内质网（ER）Ca2 + ATPase泵的抑制剂，可诱导有效的宿主先天免疫抗病毒反应，从而阻止甲型流感病毒的复制。在这里，我们显示TG还可以在永生或原代人细胞中阻断呼吸道合胞病毒（RSV），普通感冒冠状病毒OC43，SARS-CoV-2和A型流感病毒的复制。 TG的抗病毒性能在抑制OC43和RSV方面显着优于瑞贝昔韦和利巴韦林。值得注意的是，TG在合并感染中对冠状病毒（OC43和SARS-CoV-2）和流感病毒（苏联H1N1和pdm 2009 H1N1）的抑制作用相同。酸稳定TG的感染后口服管饲法可保护小鼠免于致命的流感病毒攻击。结合其在主动感染之前或期间抑制不同病毒的能力，以及在TG暴露后至少48小时的抗病毒持续时间，我们建议TG（或其衍生物）是有希望的广谱抗SARS-CoV抑制剂-2，OC43，RSV和流感病毒。

关键字：毒胡萝卜素；抑制剂抗病毒物质; SARS-CoV-2;冠状病毒OC43；呼吸道合胞病毒;流感病毒广谱先天免疫;老鼠;瑞地昔韦利巴韦林;奥司他韦

1. 介绍

在COVID-19大流行中，针对大规模疫苗接种的有效疫苗的需求从未如此大，以控制和预防可导致医院不堪重负的猖ramp的发病率，死亡率和激增的临床病例。 COVID-19是由一种新型冠状病毒引起的，该冠状病毒被称为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2），一种包膜的阳性单链RNA病毒[1]。尽管现在正在部署COVID-19疫苗，但根除是不切实际的，并且对有效抑制SARS-CoV-2抗病毒药[2,3]的平行需求存在着并行的需求，以抑制患者体内主动病毒复制以逆转病毒进程。考虑到并不是所有的疫苗都可以在随后的感染中预防病毒的脱落，因此抗病毒药也可以用来降低人群中传播的总体病毒水平，从而减少其传播。针对任何传染病使用或开发的抗病毒药物数量很少，证明了抗病毒药物开发的实际挑战。特别是对于呼吸道病毒，通常遇到的主要障碍是病毒突变抗性的出现，这种突变抗性源于直接针对病毒特定部分的普遍采用的策略。甲型流感病毒的N1部分对病毒神经氨酸酶抑制剂奥司他韦的耐药性日益引起人们的关注[4,5]。人们对令人担忧的是对新近引入的针对病毒PA蛋白的流感抗病毒药baloxavir marboxil的耐药性不断提高[6]；甲型流感病毒的PB1基因中的突变很容易赋予对新型核苷类似物抗病毒药物favipiravir的耐药性[7]。可以潜在地规避病毒突变挑战的另一种抗病毒设计方法是，在早期感染期间调节通用的宿主固有免疫反应，以充分破坏病毒复制，从而建立获得性免疫（抗体和细胞介导的）。这种新颖的以宿主为中心的抗病毒方法可以具有抑制不同类型病毒的额外好处[8]。鉴于表现出不同病因的急性呼吸道病毒感染在临床表现上是无法区分的，因此可以同时针对不同病毒类型的广谱以宿主为中心的抗病毒药可能会大大改变临床管理。

除了目前的SARS-CoV-2大流行外，甲型流感病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）仍然是造成人类呼吸道病毒感染的重要因素。流感病毒是包膜的负义分段单链RNA病毒，每年在全球范围内导致多达65万例死亡，并且是造成先前大流行的原因[9]。 RSV是一种包膜的负义单链RNA病毒，是幼儿和老年人急性下呼吸道感染的主要原因，与5岁以下儿童的院内死亡48,000–74,500相关，其中99％在发展中国家发生的死亡[10,11]。虽然在甲型流感病毒感染中使用抗病毒药可能会受到病毒抗药性的阻碍，但仅批准使用抗RSV的化学抗病毒药利巴韦林仅限于婴儿的严重感染[5,12]。

我们最近显示，毒胡萝卜素（TG）是肌浆网/内质网（ER）Ca2 + ATPase泵的抑制剂[13]，在纳摩尔非细胞毒性水平上诱导了有效的宿主抗病毒应答，从而阻断了甲型流感病毒的复制[14]。TG诱导的ER应激未折叠蛋白反应（UPR）似乎是激活宿主抗病毒防御下游谱的主要驱动力。在这里，我们显示TG实际上是一种以宿主为中心的广谱抑制剂，在永生或原代人类细胞中，可有效阻断RSV，普通感冒冠状病毒OC43，SARS-CoV-2和A型流感病毒的复制。我们还确定，胃中发现的TG是低pH稳定的，从一次引发起就能够快速诱导持续至少48小时的有效抗病毒状态，并且在小鼠口服后可在小鼠体内进行治疗性保护（体内）感染，应对致命的流感病毒挑战。

2. 材料和方法

2.1. 细胞和病毒

原代正常人支气管上皮细胞（NHBE）和支气管上皮生长培养基由Promocell（德国海德堡）提供。在添加了10％胎牛血清（FCS）的DMEM-Glutamax中培养无限增殖的新生猪气管上皮（NPTr）细胞[15]，HEp2细胞，MRC5细胞，A549细胞，Calu-3细胞，Vero E6细胞和MDCK细胞。100 U / mL青霉素-链霉素（P/S）（Gibco，ThermoFisher Scientific，佩斯利，英国）。

通过DEFRA分离出的人RSV（A2株，ATCC VR-1540），苏联H1N1（A / USSR / 77），PR8 / H1N1（A / PR8 / 1934）和pdm H1N1病毒（A / Swine / England / 1353/2009）这项研究使用了SwIV监视程序SV3401）。还使用了人冠状病毒OC43（OC43）和SARS-CoV-2病毒（2019-nCoV /意大利-INMI1株，从EVAg获得的进化枝V（008V-03893）），后者的完整序列已提交给GenBank（SARS-CoV- 2 / INMI1-Isolate / 2020 /意大利：MT066156），并且可以在GISAID网站上找到（betaCoV /意大利/ INMI1-isl / 2020：EPI_ISL_410545）。

2.2. 细胞活力测定

根据制造商的说明，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒或CellTiter-Glo 2.0细胞活力测定试剂盒（Promega，麦迪逊，威斯康星州，美国）确定细胞活力。

2.3. 细胞化学启动

根据制造商的建议，将TG（美国密苏里州圣路易斯的默克公司）和瑞德昔韦（德国慕尼黑的Selleckchem公司）溶解在DMSO中，而利巴韦林和羟氯喹（默克公司）按照制造商的建议溶解在水中。化合物的抗病毒方案对细胞活力没有可检测到的不利影响。通常，除非另有说明，否则在感染前将细胞在适当的细胞培养基中稀释的所示化合物中孵育（稀释30分钟内使用），然后孵育30分钟，然后用PBS洗涤3次并用所示病毒感染（感染前启动）。或者，首先将细胞感染指定的时间，然后将化合物灌注30分钟，然后继续进行感染培养（感染后灌注）。细胞的所有TG引发仅持续30分钟，然后根据特定实验用PBS洗涤并进行下游培养。

2.4. RSV感染和子代病毒定量

HEp-2细胞，A549细胞和NHBE细胞根据24小时噬斑测定，在补充2％FCS的DMEM-Glutamax中以指定的RSV感染复数（MOI）感染48或72小时，收集的离心上清液用于噬菌斑测定或RT-qPCR的病毒拷贝数进行定量（请参见2.6节）。以前已经描述了通过噬斑分析对HEp2细胞进行RSV滴定[16]。简而言之，将感染细胞上清液的连续稀释液（一式三份）连续感染24小时的HEp2细胞固定在丙酮：甲醇（1：1）中，并使用小鼠抗RSV（2F7）抗体（1：1000）进行免疫染色（Abcam （英国剑桥）。

2.5. 流感和冠状病毒的单一和共感染，以及子代病毒的定量

甲型流感病毒感染需要无血清培养基和胰蛋白酶。 NPTr细胞和A549细胞的感染培养基是Opti-MEM I（Gibco），辅以100 U / mL P / S，2 mM谷氨酰胺和200 ng / mLL-1-甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮（ TPCK）胰蛋白酶（Sigma-Aldrich）。根据病灶形成试验（FFA），将特定的流感病毒MOI在感染培养基中感染细胞2到3 h，然后用PBS洗涤3次，并在新鲜感染培养基中孵育24天如图所示，持续72小时。收集纺丝上清液用于通过6 hFFA，50％组织培养物感染剂量（TCID50）或通过RT-qPCR的病毒拷贝数对子代病毒进行定量。以前已经描述了通过FFA滴定流感病毒[14]。

在添加100 U/ mLP / S，2 mM谷氨酰胺和100 ng / mL TPCK胰蛋白酶的Opti-MEM I中，将A549细胞和MRC5细胞用指定的MOIOC43（基于FFA）感染OC43 3小时。用PBS洗涤3次，并在新鲜的感染培养基中孵育长达72小时。对用OC43和苏联H1N1病毒共感染的A549细胞进行了相似的处理。收集纺丝上清液用于通过FFA定量子代病毒或通过RT-qPCR定量病毒拷贝数。

在指示的MOI上，以TCID50为基础，用SARS-CoV-2将Calu-3，NHBE和Vero E6细胞感染，在补充有100U/mLP/ S，2 mM谷氨酰胺和100ng的Opti-MEMI中感染3 h。如图所示，将1mL / mL TPCK胰蛋白酶，随后在PBS中洗涤3次，并在新鲜的感染培养基中孵育总计长达72小时。对被pdm H1N1病毒和SARS-CoV-2病毒共感染的Calu-3细胞进行了相似的处理。收集纺丝上清液用于通过TCID50定量子代病毒或通过RT-qPCR定量病毒拷贝数。以96孔板形式进行TCID50滴定，以定量SARS-CoV-2和A型流感病毒，最少重复四次。

在生长培养基DMEM（Gibco）中对每个样品进行十倍稀释。然后，将50µL稀释样品分别添加到MDCK和VeroE6细胞中用于流感和SARS-CoV-2滴定，并在37°C下孵育1 h。然后将培养基换成200 µL DMEM（补充200ng /mL TPCK胰蛋白酶用于流感滴定），并在37℃下孵育5天。在显微镜下评估每个孔的细胞病变作用。使用Spearman-Karber方法以TCID50计算病毒滴度[17,18]。检测限为5.62 TCID50 / mL。

2.6. RNA制备和实时RT-PCR

RNeasy Plus Minikit（Qiagen，希尔登，德国）用于从细胞中提取总RNA。使用Superscript III First Strand合成试剂盒（ThermoFisher Scientific）从1 µg总RNA合成cDNA。用LightCycler 96仪器（Roche，Basel，Switzerland）进行宿主基因的表达。基因表达的计算基于比较的Ct方法，已标准化为18S核糖体RNA。 HSPA5（FH1_HSPA5和RH1_HSPA5），HSP90B1（FH1_HSP90B1和RH1_HSP90B1）和DDIT3（FH1_DDIT3和RH1-DDIT3）的人ER应力引物;和人类

IFNB1引物（FH1_IFNB1和RH1_IFNB1），OAS1引物（FH1_OAS1和RH1_OAS1）和RNASEL引物（FH1_RNASEL1和RH1_RNASEL1）是预先设计的Sigma-Aldrich。使用PrimerExpress 3.0.1（ThermoFisher Scientific）设计了其他引物（由Sigma-Aldrich合成），并在表1中显示。QIAamp病毒RNA试剂盒（Qiagen）用于从离心细胞培养上清液中提取病毒RNA。使用QIAGEN OneStepRT-PCR KIT进行一步实时qPCR，以定量相对病毒拷贝数。

表1.引物序列。

2.7. 蛋白质印迹

使用放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液（圣克鲁斯，达拉斯，美国德克萨斯州）补充1％苯基甲基磺酰氟（PMSF）（圣克鲁斯），1％抑制剂混合物和1％原钒酸钠，裂解细胞，并通过Bio-RAD蛋白质测定法（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）测量蛋白质浓度。一抗是1：500稀释的山羊抗甲型流感A1（Abcam，ab20910），小鼠抗甲型M2克隆14C2（1：1000）（Invitrogen，MA1082），山羊抗甲型流感病毒多克隆抗体以1：2000的稀释度（Abcam，ab155877），小鼠抗冠状病毒抗体OC-43株，克隆541–8F处于1：1000（Sigma-Aldrich，MAB9012）和小鼠抗β-肌动蛋白克隆AC- 74处于1：5000（Sigma-Aldrich，A2228）。合适的物种特异性二抗是过氧化物酶偶联的（Abcam），用于化学发光检测（Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent，美国马萨诸塞州马尔伯勒）。

2.8. 干扰素-β（IFNβ）ELISA

通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量细胞培养上清液中的IFNβ分泌。 IFNβELISA（人类IFN-βQuantikine ELISA试剂盒，美国明尼苏达州明尼阿波利斯市Bio-Techne）按照制造商的说明进行。样品进行三次重复分析。

2.9. 小鼠流感病毒挑战

为了评估TG在感染过程中（即感染后）的抗病毒效力，并与体内奥司他韦进行比较，将6至8周龄的BALB / c小鼠（雌性）分为两组，以确定感染后存活率（每个治疗组n = 8）和子代病毒产生（每个治疗组n = 8）。小鼠经鼻内感染了3个MLD50的PR8/H1N1病毒。感染后十二小时，每天通过管饲法口服TG（1.5 µg / kg /天），奥司他韦（45 mg / kg /天）或PBS + DMSO（PBS-DMSO对照中DMSO的百分率与其他治疗相当）天。在感染后第3和5天，收集每组四只小鼠的肺以进行病毒滴定。通过TCID50分析，对接种了10倍连续稀释的均质化肺组织的MDCK细胞进行病毒滴定，并在37°C下孵育72小时。 TCID50值是根据Reed–Muench方法[19]计算的。

2.10. 量化与统计分析

使用GraphPad Prism 7和图例中描述的统计方法进行统计分析。 p值<0.05被认为是显着的，并表示为* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001和**** p <0.0001。 Kaplan–Meier方法用于生存分析。给出的结果代表了三个或更多个独立的重复，除非另有说明，否则误差线为标准偏差。

2.11. 道德声明

所有动物工作均已获得北京科学技术协会（ID：SYXK（Beijing）2007–0023）的批准，并按照北京实验动物管理委员会发布的《北京实验动物福利和道德规范》进行；符合中国农业大学机构动物护理和使用委员会指南（ID：SKLAB-B-2010–003）。

3. 结果

3.1. TG阻止子代RSV生产

为了证明TG对RSV的抗病毒活性，在感染前24小时（图1A）或感染后24小时（hpi）（图1B）用TG短暂灌注人HEp2和A549细胞30分钟。每种细胞类型的感染前和感染后TG引发导致后代病毒产量显着下降（统计上显着）。感染前用0.5 µM TG引发的HEp2细胞将子代病毒的产生减少了近10,000倍（图1A）；在24 hpi时用0.5 µM TG引发的细胞将病毒输出降低约1000倍（图1B），这分别表明其对RSV的预防和治疗抗病毒潜力。用TG对HEp2和A549细胞进行30分钟的单次启动诱导了有效的抗病毒状态，这种状态持续至少48小时（图1C，D）。 TG引发HEp2细胞（感染前即刻或感染前48小时）引发了病毒L，F和M基因的转录抑制（图1E，F）。所用TG的抗病毒方案对HEp2和A549细胞无细胞毒性（图1G，H）。补充证据TG的非细胞毒性抗病毒剂量方案已在我们较早的出版物中发现[14]。因此，TG作为一种非细胞毒性抑制剂具有快速作用，可在持续至少48小时的细胞中诱导抗病毒状态，并且在主动RSV感染之前或期间使用时是有效的。

接下来，根据被感染的HEp2细胞的后代病毒产量（图2A）和病毒RNA检测（图2B），将TG的抗病毒性能与病毒唑进行比较，利巴韦林是一种被批准用于严重RSV感染的幼儿的抗病毒药物。 TG在阻止RSV复制方面优于病毒唑。例如，用0.1µM TG感染HEp2细胞预感染30分钟对子代病毒产生的抑制作用比连续使用30 µM利巴韦林（50％利巴韦林有效浓度（EC50）对RSV = 11）高160倍。 µM [20]）（图2A）。 TG在HEp2细胞的RSV抑制中表现出984的选择性指数（50％（CC50）/ EC50的细胞毒性浓度）和84.55 nM的EC90，这表明它具有很强的安全裕度（图2C，D）。在由TG引发和感染的原代NHBE细胞中，相应培养基中病毒RNA的检测降低（图2E）与病毒L，F和M基因的转录抑制（图2F）同时发生，这进一步表现为TG剂量依赖性减少病毒蛋白的产生（图2G，H）。

两者合计，TG作为抗病毒剂比利巴韦林更有效，表现出很强的选择性指数，并阻断了RSV病毒的转录和病毒蛋白的产生。在原代NHBE细胞中，相对于DMSO对照，在RSV感染之前和期间，TG依赖于TG的剂量以TG剂量依赖性的方式进行了TG的感染前致敏增强ER应激基因（DDIT3，HSPA5和HSP90B1）的表达（图3A，C）。TG还增加了NHBE细胞中RIG-I信号相关基因（RIG-I，IFNB和RNASEL）的基础表达，但是在感染过程中，相对于被感染的DMSO对照，RIG-I相关基因的诱导显着衰减（图3D，G）。因此，在NHBE细胞中RSV感染期间，RIG-I相关基因的转录诱导减少是一个特征。TG介导的RSV抑制作用。

3.2. TG阻止子代冠状病毒OC43的生产

为了证明TG对冠状病毒的抑制作用，在感染地方性OC43病毒之前，立即用TG引发A549细胞30分钟[21]（图4A–C）。以剂量依赖性方式，TG阻断了病毒复制，如感染细胞的培养基中病毒RNA的急剧减少（图4A），病毒转录的抑制（图4B）和病毒NP蛋白生成减少（图4C）所证明。将TG的抗病毒性能与羟氯喹（HC）进行了比较，后者是一种毒性比氯喹低的化合物，可抑制OC43[22]。 TG在阻止子代OC43病毒产生方面比HC更有效（图4D，E）。感染前引发与整个感染过程中连续使用20 µM HC相比，0.05 µM TG仅持续30分钟对OC43的抑制作用更大（针对SARS-CoV-2的HC EC50 = 4.51 µM [23]）（图4D）。

与HC处理后代病毒的适度减少不同，在TG引发的感染细胞的培养基中几乎未检测到任何病毒（图4E）。在A549细胞中，TG在阻止OC43病毒（图4F）和流感病毒（图4G）复制方面比最近被批准用于SARS-CoV-2感染紧急使用的核苷类似物Remdesivir（RDV）[24]更好。 。尽管在72hpi时，细胞连续暴露于0.3 µM RDV（RDV EC50对OC43 = 0.15 µM [24]）显示约17,000倍

减少子代病毒RNA的检测（相对于相应的DMSO对照）；细胞反过来，用0.3 µM TG引发的细胞则比RDV处理过的细胞具有450倍的抑制作用（图4F）。在72 hpi时，与0.3μM的RDV连续使用相比，0.05μMTG引发的细胞对苏联H1N1病毒的抑制作用还强于7倍。 RDV对流感病毒复制几乎没有抗病毒作用（图4G）。 TG在A549细胞中的抗病毒用途无细胞毒性（图4H）。 TG在MRC5细胞中OC43上的TG的选择性指数（CC50 / EC50）高，介于7072和9227之间（图4I）。总的来说，TG强烈抑制OC43病毒的转录和蛋白质产生，作为抗病毒剂比HC和RDV更有效，并且具有较高的选择性指数。

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