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福昕翻译是一款非常方便易用的翻译工具，您只需在网上搜索福昕翻译并进入官方下载平台即可轻松下载安装。它的操作界面简洁易懂，您只需跟着指示即可完成文档翻译的工作，即使您没有英语或其他语言的基础也可以使用。接下来我们可以一起来看一下“平湖免费文档翻译用什么工具好？福昕翻译文档的步骤是什么？”相关的资讯吧。
平湖免费文档翻译用什么工具好？
福昕翻译支持近40种格式，还能完好保留原文格式。另外，还有语音翻译、文字翻译和拍照翻译，是非常方便的。而且想查单词的时候就不用下载英语词典、法语词典等等，文字翻译还是比较方便的，可选语种，也可选翻译引擎，还节省了内存呢？
福昕翻译文档的步骤是什么？
首先设置翻译的语言，点击【审阅】--【翻译】--【选择翻译语言】；设置翻译的语言和翻译屏幕提示语；以【英语】翻译成【中文】，提示语为【中文】为例；点击【审阅】--【翻译】--【翻译屏幕提示】，提示语，点击确定；选中文字，停留片刻，就会看到上方浮现翻译的中文，这样一个翻译文档就完成了。
估计大家通过小编的介绍已经了解了关于“平湖免费文档翻译用什么工具好？福昕翻译文档的步骤是什么？”的资讯了，此外
2023-06-12 15:30:05
为了能在论文写作过程中有更多地时间查阅相关文献资料，就需要对文献资料进行进一步深入的阅读和分析，而这也就是翻译软件可以帮助我们实现阅读文献资料和分析文献资料的目的。那么，自动翻译word文献哪款软件好？一起来跟随福昕翻译大师了解一下吧！
自动翻译word文献哪款软件好？
能够自动翻译word文献的软件，当然是福昕翻译大师最好用了，福昕翻译大师一款支持多种文档类型、短句、图片以及语音翻译等功能的多语种翻译软件。文档翻译支持英语、日语、韩语、德语、法语、俄语、葡萄牙语、西班牙语等26个国家的语言，文档翻译，还可以使用图片翻译，如果想要更准确的翻译，就可以使用福昕翻译大师的人工翻译功能，满足您的翻译需求。
怎么免费翻译英语文档？
1.在浏览器中输入“福昕翻译大师”，进入官网，并且下载软件。
2.进入翻译界面之后，点击“上传文档”，上传需要翻译的pdf或word文档，然后选择对应需要翻译的语言，如“中文翻译英文”或“英文翻译中文”。
3.文档上传成功后，点击“翻译”，进行平台自动翻译。
4.翻译成功后，界面会显示中英文对照，然后点击“导出翻译文档“，即可将翻译的内容导出为
2023-02-22 14:00:06
想要针对文档进行翻译，大家也可以借助软件来实现。在众多翻译软件中，挑选出易用性更强的并不简单。哪个南宁文档翻译软件好？对于这个问题，福昕翻译整理了相关的内容。
哪个南宁文档翻译软件好？
福昕翻译是一款专业的翻译软件，涵盖了大部分翻译相关的功能，可以满足大部分的识别和翻译需求。首先我们找到并打开这个软件工具，点击【文档翻译】，再在文件选择一栏点击我们需要翻译的文档，选择要翻译的语言，然后点击【立即翻译】，等待几秒钟，整个文档将被翻译。我们可以直接点击【查看文件】获得翻译结果。
怎么免费翻译一份文档？
1、我们打开翻译软件之后，在界面中找到文档翻译这个选项，点击以后，然后再点击“选择文档”按钮。
2、点击“选择文档”之后，在出现的界面中选中想要处理的文档，然后点击右下角的“打开”即可添加到软件中。
3、将要处理的文档添加到软件界面之后，我们可以选择翻译方式，选择免费版需要消耗额度，选择之后设置好想要翻译的语言，点击开始翻译按钮即可。
4、界面中可以看到消耗额度下方显示的翻译进度条，等待翻译完成即可。
上文内容主要针对南宁文档翻译软件进行了介绍，供大家作为参考。想要更
2023-02-05 16:06:07
我们在翻译外文资料时，都想要尽量的节省一些费用，而且最好是可以进行免费翻译。下面大家就和福昕翻译一起来了解怎么免费翻译法语ppt材料？商务英语翻译的需求是什么？
怎么免费翻译法语ppt材料
大家免费翻译法语ppt材料时，可以下载一款免费软件。现在不少翻译软件都免费，而且除了翻译功能以外，大多数软件还支持用户在线学习外语，满足用户在线学习外语的需求，从基础单词到口语练习，都是非常方便的。
商务英语翻译的需求是什么
1、词义引伸
在商务英语翻译中，有时会遇到某些词在词典上难以找到贴切的具体上下文词义，若生搬硬套，译文往往语意不清，甚至导致误解。在这种情况下，需要根据上下文和逻辑关系，从该词固有基本含义出发，进一步加以引伸。
2、词量增减
在商务英语翻译实践中，词量增减也是很重要的。翻译过程中要根据原文上下文意思、逻辑关系以及译文语言句法特点和表达习惯，在翻译时适当增减词语。其实中间也是一个特别好的方法，比如说当你对某个生词不了解的时候，你可以去加一个联系词这些都是可以的。
大家想要免费翻译法语ppt材料，最为简单的方法便是下载翻译软件了。据福昕翻译了解，现在网上各类
2022-11-20 00:24:01
大家人工翻译外文资料的话，收费是比较高的，所以又不少朋友都想要免费翻译文件。下面大家就和福昕翻译一起来了解怎么免费翻译法语excel文件？本地化翻译的要求有哪些？
怎么免费翻译法语excel文件
想要免费翻译法语excel文件，大家可以下载免费的翻译软件，它最大的优点就是省钱，而且翻译的速度非常快，大家在软件中输入一段文字，瞬间就能看到结果。并且现在很多软件还实现了对整段文字以及整篇文章的翻译，这样的速度是人工所不能比拟的。
本地化翻译的要求有哪些
进行本地化翻译的时候，要求句子的结构严谨。翻译公司中的本地化翻译从文体上看，大多是论述性，指南性，多用陈述句、祈使句平铺直叙，少有感情色彩。 句子结构简练严谨，常采用省略手法，用短语来代替从句。 词汇力求短小精悍，常用复合词，技术性越强，复合词越多。 在表现手法上力求客观性，避免主观性和个人色彩，被动语态使用较多，以使句子紧凑，主语信息丰富，避免重复。文章结构层次分明，连接词的使用十分频繁和重要。
福昕翻译认为，如果想要免费翻译法语excel文件的话，便可以下载一款翻译软件，大家用搜索引擎就可以找到很多的免费翻译软件。
2022-11-18 13:30:44
表格的翻译相对来说难度更高，因为它可能涉及到很多专业名词，如果翻译不准确可能会导致一些问题发生。到底翻译excel资料哪个好？如果对这个问题感兴趣，不妨看看下文福昕翻译所做的介绍。
翻译excel资料哪个好？
小编想推荐的这款免费翻译软件名叫福昕翻译，这款软件可以智能翻译引擎，智能判别语境呈现媲美人工翻译的精准译文.在线免费翻译文档、语句让每个人都能0成本试用翻译。智能AI翻译，支持多语种。适合商贸交流，邮件往来，资料文献等非正式场合译文参考的需求。
怎么免费翻译excel资料？
1.在浏览器中输入“福昕翻译”，进入官网，并且下载软件。
2.进入翻译界面之后，点击“上传文档”，上传需要翻译的excel文档，然后选择对应需要翻译的语言，如“中文翻译英文”或“英文翻译中文”。
3.文档上传成功后，点击“翻译”，进行平台自动翻译。
4.翻译成功后，界面会显示中英文对照，然后点击“导出翻译文档“，即可将翻译的内容导出为excel文档。
翻译excel资料哪个好，上文内容可供大家参考。在拿到一个表格文件且需要完成翻译工作的时候，可以借助福昕翻译来快速、高效地完成。
2022-11-13 20:52:50
现在各类的翻译软件非常多，我们在选择翻译软件的时候，还是要看它的精准度和速度，今天小编就给大家介绍一下恩施word翻译软件哪个好？怎么免费翻译文件？感兴趣的小伙伴可以了解一下。
恩施word翻译软件哪个好
在各类的文档翻译软件中，福昕翻译非常好用，它是一款多功能的文件翻译器,软件集合了文档翻译(txt,word,ppt,excel,pdf)、图片翻译(jpg,jpeg,bmp,png)、语音翻译(amr,wav,mp3,m4a)、短语翻译;文档翻译支持中文、英语、日语、韩语、德语、法语、俄语、葡萄牙语、西班牙语等多个国家的语言。福昕翻译拥有智能翻译引擎，闪电翻译，无需人工，翻译100页仅需59秒，还可以根据内容调整译文智能呈现精准翻译结果。
怎么免费翻译文件
1. 在浏览器中输入“福昕翻译”，进入官网，并且下载软件。
2. 进入翻译界面之后，点击“上传文档”，上传需要翻译的word文档，然后选择对应需要翻译的语言，如“中文翻译英文”或“英文翻译中文”。
3. 文档上传成功后，点击“翻译”，进行平台自动翻译。
4. 翻译成功后，界面会显示中英文对照，然后点击“导出翻
2022-10-03 02:44:29
世界上的语言种类有很多，当遇到一个外语表格文档且需要了解它内容的时候，可以使用软件对它进行翻译。翻译软件有很多，那么通辽excel翻译用哪个软件？福昕翻译会在下文进行解答。
通辽excel翻译用哪个软件？
通辽地区的小伙伴们可以使用福昕翻译，这是小编使用过最好的翻译软件，它支持文字、图片、文档等多种类型的翻译服务，并且还提供免费翻译次数，这样大家在翻译文档时就可以少花钱，并且翻译质量还非常的有保证。不仅翻译免费，还提供24小时全天候的服务，翻译的种类很多，主要有专业翻译，高保真翻译，截图翻译。
怎么免费翻译excel文档？
1.登录网址https://fanyi.pdf365.cn/，或者通过浏览器搜索“福昕翻译”，进入福昕翻译首页，
2.选择【文档翻译】功能后，上传需要翻译的文件，也可以多份文件同时移动或者上传，
3.根据提示选择好需要翻译的需求，主要是翻译语言，全部选择好后，点击【开始翻译】，系统就会自动翻译文件。
4.翻译完成后，点击右侧【阅读】按钮，就可以在线查看译文，在阅览页面也可以操作下载译文。
通辽excel翻译用哪个软件？福昕翻译可以快速对表格文
2022-08-22 15:27:44
说起文档翻译对于外语不精通的人来说真的是要煞费苦心，有的人采用最原始的方法就是复制内容一段一段的进行翻译，这样做的结果就是单个词语直译，整个文档翻译下来词不达意，既浪费时间又无法使用译文，且正式场合使用也不合时宜，当然翻译文档的方式方法多种多样，各有各的招。那么，成华区怎么免费翻译文档呢？成都市免费文档翻译的平台哪个好？
成华区怎么免费翻译文档呢？
1、搜索福昕翻译，进入官网后，点击导航栏的【文档翻译】。
2、点击【添加文件】上传需要翻译的文档，选择试用版翻译模式。
3、设置翻译需求和翻译语言，点击【开始翻译】，系统自动完成翻译。
4、翻译完成，可在线对比阅读或者直接下载译文保存。
成都市免费文档翻译平台哪个好？
成都市免费翻译文档的平台有很多，但也有雷区。有的免费翻译平台格式有限制，有的对需翻译文档的兆数有要求。这里推荐好用的福昕翻译给大家，可免费使用，在文档翻译页面上有按钮点击就可以上传文档，支持pdf、word、ppt、excel等格式文档翻译；支持27国语言互译；支持下载保留原文样式排版的“高保真”译文。
以上就是关于成华区怎么免费翻译文档
2022-02-15 00:03:03
在以前翻译外语都是通过人工一个字词进行翻译，这种翻译不仅效率不高，准确度那就不用多说了，网络越来越发达，软件技术越来越先进，现在各式各样的翻译软件供大家选择，读书和工作都离不开翻译，可见在线翻译的重要性，相信大家也遇到很多整篇文档翻译下来，需要支付费用，专业性又不强，还耽误时间，不防和福昕翻译一起来看看在双流区怎么免费翻译文档，在线翻译操作步骤又是怎样的？
一，双流区怎么免费翻译文档
目前翻译软件很多，各种各样的供大家选择，很多都不是免费可以使用，福昕既专业又好用，文档直接导入直接翻译。
福昕支持各种文档，目前可以英译中、中译英；可以进行文件格式的各种转化。可以说功能非常强大，而且大部分使用都是免费的。
二，成都市在线翻译操作方法
打开福昕翻译客户端，找到下载按钮，然后点击它。然后选择“文档翻译”,上传需要翻译的PDF文档。选择高保真翻译，确认翻译语言和翻译需求，有默认选项可以自己选择需求，没问题后点击开始翻译。翻译完成后点击文档下载就完成了。
以上双流区怎么免费翻译文档，和在线操作方法小编就整理到这里啦，福昕翻译不仅可以免费翻译，还支持多种文档格式，
2022-02-14 22:09:35
SARS-CoV-2尖峰损害DNA 损伤修复并抑制体外 V(D)J 重组
经过江惠和梅亚芳
1 分子生物科学系，温纳-格伦研究所，斯德哥尔摩大学，SE-10691斯德哥尔摩，瑞典
2 临床微生物学系，病毒学，于默奥大学，SE-90185 于默奥，瑞典
* 通讯作者：hui.jiang@su.se (H.J.); ya-fang.mei@umu.se (Y.-F.M.)
学术编辑：Oliver Schildgen 收稿日期：2021年 8 月 20日
接受：2021 年10 月 8 日
发布时间：2021 年10 月 13 日
出版商注：MDPI 对已出版地图和机构附属机构的管辖权主张保持中立。
版权所有：© 2021作者。被许可方 MDPI，瑞士巴塞尔。本文是根据知识共享署名(CC BY) 许可 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 的条款和条件分发的开放获取文章。
摘要：严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 已导致 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 大流行，严重影响了公共卫生和全球经济。适应性免疫在对抗 SARS-CoV-2 感染中起着至关重要的作用，并直接影响患者的临床结果。临床研究表明，重症 COVID-19 患者表现出延迟和弱的适应性免疫反应;然而，SARS-CoV-2阻碍适应性免疫的机制仍不清楚。在这里，通过使用体外细胞系，我们报告说 SARS-CoV-2 刺突蛋白显着抑制 DNA 损伤修复，这是适应性免疫中有效的 V(D)J 重组所必需的。从机制上讲，我们发现刺突蛋白定位在细胞核中，并通过阻止关键 DNA 修复蛋白 BRCA1 和 53BP1 募集到损伤部位来抑制 DNA 损伤修复。我们的研究结果揭示了刺突蛋白可能阻碍适应性免疫的潜在分子机制，并强调了全长基于刺突的疫苗的潜在副作用。
关键词：SARS-CoV-2;长钉; DNA损伤修复; V(D)J重组;疫苗
1. 介绍
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 是 2019 年持续的冠状病毒病 (COVID-19) 大流行的罪魁祸首，已导致超过 230 万人死亡。 SARS-CoV-2 是一种有包膜的单链正链 RNA 病毒，由结构蛋白和非结构蛋白组成 [1]。感染后，这些病毒蛋白会劫持宿主细胞机制并使其失调，以复制、组装和传播后代病毒 [2]。最近的临床研究表明，SARS-CoV-2 感染会异常影响淋巴细胞的数量和功能 [3-6]。与轻度和中度幸存者相比，重度 COVID-19 患者的总 T 细胞、辅助 T 细胞和抑制性 T 细胞的数量显着减少 [3,4]。此外，COVID-19 在症状出现后延迟 IgG 和 IgM 水平 [5,6]。总的来说，这些临床观察表明 SARS-CoV-2 影响适应性免疫系统。然而，SARS-CoV-2抑制适应性免疫的机制尚不清楚。
作为两个关键的宿主监视系统，免疫和 DNA 修复系统是高等生物抵御各种威胁和组织稳态的主要系统。新出现的证据表明，这两个系统是相互依赖的，尤其是在淋巴细胞发育和成熟过程中 [7]。作为主要的双链 DNA 断裂 (DSB) 修复途径之一，非同源末端连接 (NHEJ) 修复在淋巴细胞特异性重组激活基因核酸内切酶 (RAG) 介导的 V(D)J 重组中起着关键作用，这导致 B 细胞中的抗体和 T 细胞中的 T 细胞受体 (TCR) 具有高度多样化的抗体库 [8]。例如，关键 DNA 修复蛋白(如 ATM、DNA-PKcs、53BP1 等)的功能丧失会导致 NHEJ 修复缺陷，从而抑制功能性 B 和 T 细胞的产生，从而导致免疫缺陷[7,9 –11]。相比之下，病毒感染通常通过以下方式诱导 DNA 损伤不同的机制，例如诱导活性氧 (ROS) 产生和宿主细胞复制应激 [12-14]。如果 DNA 损伤不能得到妥善修复，就会导致病毒感染引起的病理放大。因此，我们旨在研究 SARS-CoV-2 蛋白是否劫持 DNA损伤修复系统，从而影响体外适应性免疫。
2. 材料和方法
2.1. 抗体和试剂
DAPI(货号 #MBD0015)、阿霉素(货号 #D1515)、H2O2(货号 #H1009)和β-微管蛋白抗体(货号 #T4026)购自Sigma-Aldrich。针对 His 标签的抗体(货号 #12698)、H2A(货号#12349)、H2A.X(货号 #7631)、γ–H2A.X(货号 #2577)、Ku80(货号 #2753)、和 Rad51(Cat #8875) 购自 Cell Signaling Technology (Danvers, MA,USA)。53BP1(Cat #NB100-304)和 RNF168(Cat #H00165918–M01)抗体获自 Novus Biologicals(Novus Biologicals，Littleton，CO，USA)。 Lamin B (Cat #sc–374015)、ATM (Cat#sc–135663)、DNA–PK(Cat #sc–5282) 和BRCA1(Cat#sc–28383) 抗体购自 SantaCruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology)美国加利福尼亚州克鲁兹)。 XRCC4 (Cat #PA5–82264) 抗体购自 Thermo Fisher Scientific (Waltham,MA, USA)。
2.2. 质粒
pHPRT-DRGFP 和 pCBASceI 由 Maria Jasin(Addgene 质粒 #26476 和 #26477) [15] 提供。pimEJ5GFP是 Jeremy Stark 的礼物(Addgene plasmid #44026)[16]。 NSP1、NSP9、NSP13、NSP14、NSP16、spike 和核衣壳蛋白首先通过密码子优化合成，然后克隆到带有 C 端 6xHis 标签的哺乳动物表达载体 pUC57 中。为V(D)J 报告载体合成了一个 12-间隔 RSS-GFP 反向互补序列 - 一个 23-间隔 RSS。然后，将序列克隆到 pBabe-IRES-mRFP 载体中以生成 pBabe-12RSS-GFPi-23RSS-IRES-mRFP 报告载体。 12-spacer RSS 序列：5'-CACAGTGCCTACAGACTGGAACAAAAACC-3'。 23-间隔 RSS 序列：5'-CACAGTGGTAGTACTCCACTGTCTGGCTGTACAAAAACC-3'。 RAG1 和 RAG2
表达构建体由 Martin Gellert(Addgene 质粒 #13328 和 #13329)慷慨赠予 [17]。
2.3. 细胞和细胞培养
从美国典型培养物保藏中心 (ATCC) 获得的 HEK293T 和 HEK293 细胞在 37°C 的 5% CO2 下在含有 10% (v/v) 胎牛血清 (FCS, Gibco)、1% (v/v) 青霉素 (100 IU/mL)和链霉素 (100 µg/mL)。 HEK293T-DR-GFP 和 HEK293T-EJ5-GFP 报告细胞如前所述生成并在 5% CO2下在 37°C 下在上述培养基中培养。
2.4. HR和 NHEJ 报告基因检测
如前所述，使用 DR-GFP 和EJ5-GFP 稳定细胞测量HEK293T 细胞中的 HR 和 NHEJ 修复。简而言之，将 0.5 106 HEK293T 稳定报告细胞接种在 6 孔板中，并用 2 µg I-SceI 表达质粒 (pCBASceI) 与SARS-CoV-2 蛋白表达质粒一起转染。转染和阿司匹林处理后 48 小时，收集细胞并通过流式细胞术分析 GFP 表达。平均值来自三个独立的实验。
2.5. 细胞分离和免疫印迹
对于细胞分数测定，根据制造商的说明使用亚细胞蛋白质分馏试剂盒(Thermo Fisher)。使用 BCA 试剂(Thermo Fisher Scientific,Rockford, IL, USA)对蛋白质裂解物进行定量。蛋白质被解析
通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转移到硝酸纤维素膜(Amersham protran，0.45 µm NC)，并用特定的一抗进行免疫印迹，然后是 HRP 偶联的二抗。使用 SuperSignal West Pico 或 Femto 化学发光试剂盒(Thermo Fisher Scientific)检测蛋白质条带。
2.6. 彗星试验
细胞用不同的 DNA 损伤试剂处理，然后在指定的时间点收集用于分析。将细胞(1 105 个细胞/mL 在冷磷酸盐缓冲盐水 [PBS] 中)在 40°C 下以 1:3 vol/vol 的比例重新悬浮在 1% 低熔点琼脂糖中，并移液到CometSlide上。然后将载玻片浸入预冷的裂解缓冲液(1.2 M NaCl、100 mM EDTA、0.1% 月桂基肌氨酸钠、0.26 M NaOH pH > 13)中，在 4°C 黑暗中过夜(18-20 小时)裂解。然后小心取出载玻片并在室温 (RT) 下在黑暗中浸入冲洗缓冲液(0.03 M NaOH 和 2 mM EDTA，pH > 12)中 20 分钟。该洗涤步骤重复两次。将载玻片转移到含有冲洗缓冲液的水平电泳室中，并在0.6 V/cm 的电压下分离 25 分钟。最后，用蒸馏水清洗载玻片，用 10 µg/mL 碘化丙啶染色，并通过荧光显微镜进行分析。使用斐济软件评估和量化每个样本中大约有 100 个细胞的 20 个视野，以确定尾长(尾矩)。
2.7. 免疫荧光
将细胞接种在 12 孔板的玻璃盖玻片上，并用指定的质粒转染 24 小时。然后，根据实验设置用或不用 DNA 损伤试剂处理细胞。在室温下，将细胞在 PBS 中的 4% 多聚甲醛 (PFA) 中固定 20 分钟，然后在 0.5% Triton X-100 中透化 10 分钟。载玻片在 5% 的正常山羊血清 (NGS) 中封闭，并与稀释在 1% NGS 中的一抗在 4°C 下孵育过夜。然后将样品与用 Alexa Fluor 488 或 555 (Invitrogen) 标记的指定二抗一起在室温下在 1% NGS 中稀释 1 小时。此后，它们在室温下用 DAPI 染色 15 分钟。盖玻片使用 Dako 荧光封固介质 (Agilent) 封固，并使用尼康共聚焦显微镜 (Eclipse C1 Plus) 成像。所有评分均在盲法条件下进行。
2.8. V(D)J 重组分析
简而言之，V(D)J 报告质粒包含反向 GFP 和 IRES，驱动持续表达的 RFP。持续表达的 RFP 是内部转染对照。重组激活基因1/2(RAG1/2)共转染细胞后，RAG1/2将切断RSS并介导DSBs的诱导，如果发生V(D)J重组，倒转的GFPs被NHEJ以正序连接修理。然后细胞将表达功能性 GFP。因此，GFP 和RFP 双阳性细胞是 V(D)J 报告基因检测的读数 [18]。以 1 µg V(D)J GFP 报告基因：0.5 µg RAG1：0.5 的比例，单独使用 V(D)J GFP 报告基因(背景)或与 RAG1 和 RAG2 表达构建体组合转染 70% 汇合度的 293T 细胞微克 RAG2。第二天，更换培养基，再过 48 小时后，收获细胞并通过流式细胞术分析 GFP 和 RFP 表达。
2.9. 统计分析
使用独立收集或制备的样品将所有实验重复至少 3 次。数据通过 Studentt 检验或 ANOVA 分析，然后使用 GraphPad 8 进行 Tukey 多重比较检验。
3. 结果
3.1. 核定位的 SARS-CoV-2 病毒蛋白对 DNA损伤修复的影响
DNA 损伤修复主要发生在细胞核中，以确保基因组的稳定性。尽管 SARS-CoV-2 蛋白是在细胞质中合成的 [1]，但在细胞核中也可检测到一些病毒蛋白，包括 Nsp1、Nsp5、Nsp9、Nsp13、Nsp14 和 Nsp16 [19]。我们研究了这些核定位的 SARS-CoV-2 蛋白是否影响宿主细胞 DNA 损伤修复系统。为此，我们构建了这些病毒蛋白表达质粒以及刺突和核蛋白表达质粒，它们通常被认为是细胞质定位蛋白。我们通过免疫印迹和免疫荧光证实了它们的表达和定位(图 1A 和 S1A)。我们的结果与之前的研究一致 [19]; Nsp1、Nsp5、Nsp9、Nsp13、Nsp14和Nsp16蛋白确实定位于细胞核中，而核蛋白主要定位于细胞质中。令人惊讶的是，我们在细胞核中发现了大量的刺突蛋白(图 1A)。 NHEJ 修复和同源重组 (HR) 修复是两种主要的 DNA 修复途径，它们不仅持续监测和确保基因组完整性，而且对适应性免疫细胞功能也至关重要 [9]。为了评估这些病毒蛋白是否阻碍 DSB 修复途径，我们使用同向重复 - 绿色荧光蛋白 (DR-GFP) 和总 NHEJ-GFP 检查了由 I-SceI 核酸内切酶诱导的位点特异性 DSB 的修复。 EJ5-GFP)分别用于 HR 和 NHEJ 的报告系统 [15,16]。 Nsp1、Nsp5、Nsp13、Nsp14 和刺突蛋白的过表达降低了 HR 和 NHEJ 修复的效率(图 1B-E 和 S2A、B)。此外，我们还发现与其他研究的蛋白质相比，Nsp1、Nsp5、Nsp13和 Nsp14 过表达显着抑制了增殖(图 S3A、B)。因此，Nsp1、Nsp5、Nsp13和 Nsp14 对 DNA 损伤修复的抑制作用可能是由于继发效应，如生长停滞和细胞死亡。有趣的是，过表达的刺突蛋白不影响细胞形态或增殖，但显着抑制 HR 和 NHEJ 修复(图 1B-E、S2A、B 和 S3A、B)。
3.2. SARS-CoV-2尖峰蛋白抑制 DNA 损伤修复
因为刺突蛋白对于介导病毒进入宿主细胞至关重要，并且是大多数疫苗策略的重点 [20,21]，我们进一步研究了刺突蛋白在 DNA 损伤修复及其相关 V(D)J 重组中的作用。尖峰蛋白通常被认为是在粗面内质网 (ER) 上合成的[1]。在糖基化等翻译后修饰后，刺突蛋白与其他病毒蛋白一起通过细胞膜装置运输，形成成熟的病毒体 [1]。 Spike 蛋白包含两个主要亚基 S1 和 S2，以及几个功能域或重复序列 [22](图 2A)。在天然状态下，刺突蛋白作为无活性的全长蛋白存在。在病毒感染期间，宿主细胞蛋白酶(例如弗林蛋白酶)通过将 S 蛋白切割成 S1 和 S2 亚基来激活它，这是病毒进入靶细胞所必需的 [23]。我们进一步探索了刺突蛋白的不同亚基，以阐明 DNA 修复抑制所需的功能特征。只有全长刺突蛋白强烈抑制 NHEJ 和 HR 修复(图 2B-E 和 S4A、B)。接下来，我们试图确定刺突蛋白是否通过抑制 DSB 修复直接导致基因组不稳定。我们使用彗星试验监测 DSB 的水平。经过不同的 DNA 损伤处理，例如 γ 辐射、多柔比星处理和 H2O2 处理，在刺突蛋白存在的情况下修复较少(图 2F、G)。总之，这些数据表明刺突蛋白直接影响细胞核中的 DNA 修复。
图 1. 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 核定位蛋白对 DNA 损伤修复的影响。 (A) SARS-CoV-2蛋白的亚细胞分布。在将表达病毒蛋白的质粒转染到 HEK293T 细胞后 24 小时进行免疫荧光。比例尺：10 µm。 (B) 用于监测非同源末端连接 (NHEJ) 的 EJ5-GFP 报告器的示意图。 (C) 空载体 (E.V) 和 SARS-CoV-2 蛋白对 NHEJ DNA 修复的影响。这些值代表来自三个独立实验的平均值 ± 标准偏差 (SD)(参见图 S2A 中的代表性 FACS 图)。 (D) 用于监测同源重组 (HR) 的 DR-GFP 报告基因示意图。 (E) E.V 和 SARS-CoV-2 蛋白对HR DNA 修复的影响。这些值代表来自三个独立实验的平均值 ± SD(参见图 S2B 中的代表性 FACS 图)。这些值代表平均值 ± SD，n = 3。使用(C,E) 中的单向方差分析 (ANOVA)确定统计显着性。 ** p < 0.01，*** p< 0.001，****p<0.0001。
图 2. 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 刺突蛋白抑制 DNA 损伤修复。 (A) SARS-CoV-2刺突蛋白的一级结构示意图。 S1 亚基包括一个 N 端域(NTD，14-305 个残基)和一个受体结合域(RBD，319-541 个残基)。 S2 亚基由融合肽(FP，788-806 个残基)、七肽重复序列 1(HR1，912-984 个残基)、HR2(1163-1213 个残基)、TM 结构域(TM，1213-1237 个残基)和细胞质结构域(CT，1237-1273 个残基)。 (B,C) 刺突蛋白的滴定表达对HEK-293T 细胞 DNA 修复的影响。 (D,E) 只有全长刺突蛋白抑制非同源末端连接 (NHEJ)和同源重组(HR) DNA 修复。这些值代表来自三个独立实验的平均值 ± SD(参见图 S4A、B 中的代表性 FACS图)。 (F) 在不同的DNA 损伤条件下，全长尖峰 (S-FL) 蛋白转染的 HEK293T细胞比空载体、S1 和 S2 转染的细胞表现出更多的 DNA 损伤。对于阿霉素：4 µg/mL，2 小时。对于γ-辐照：10 Gy，30 分钟。对于 H2O2：100 µM，1 小时。比例尺：50 µm。 (G) 来自 20 个不同领域的彗星尾矩的相应量化，其中 n > 200 颗彗星来自三个独立实验。使用双向方差分析 (ANOVA)评估统计显着性。 NS(不显着)：* p > 0.05，** p <0.01，*** p < 0.001，****p<0.0001。
3.3. 尖峰蛋白阻碍 DNA 损伤修复检查点蛋白的募集
为了证实细胞核中刺突蛋白的存在，我们进行了亚细胞组分分析，发现刺突蛋白不仅在细胞膜组分中富集，而且在细胞核组分中也很丰富，甚至在染色质结合的区域也有可检测的表达。分数 (图 3A)。我们还观察到尖峰具有三种不同的形式，较高的条带是高度糖基化的尖峰，中间的一个是全长的尖峰，而下一个是切割的尖峰亚基。与彗星试验一致，我们还发现 DNA 损伤标记物 γ–H2A.X 在穗状花序中的上调DNA 损伤条件下蛋白质过表达的细胞(图 3B)。最近的一项研究表明，刺突蛋白会诱导内质网应激和内质网相关蛋白降解 [24]。为了排除刺突蛋白通过促进DNA修复蛋白降解来抑制DNA修复的可能性，我们检测了一些必需的DNA修复蛋白在NHEJ和HR修复途径中的表达，发现这些DNA修复蛋白在刺突蛋白过表达后是稳定的。图 3C)。为了确定刺突蛋白如何抑制 NHEJ 和 HR 修复途径，我们分析了 BRCA1 和 53BP1 的募集，它们分别是 HR 和 NHEJ 修复的关键检查点蛋白。我们发现刺突蛋白显着抑制了 BRCA1 和 53BP1 病灶的形成(图 3D-G)。总之，这些数据表明 SARS-CoV-2 全长刺突蛋白通过阻碍 DNA 修复蛋白的募集来抑制 DNA 损伤修复。
图 3. 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 刺突蛋白阻碍 DNA 损伤修复检查点蛋白的募集。 (A) 对转染 SARS-CoV-2 刺突蛋白的 HEK293T 细胞的膜组分 (MF)、胞质组分 (CF)、可溶性核组分 (SNF) 和染色质结合组分 (CBF)进行免疫印迹以获取 His 标签刺突和指示的蛋白质。 (B) 左图：空载体 (E.V) 中 DNA 损伤标记物 γH2AX 的免疫印迹，以及 10 Gy γ 辐射后表达刺突蛋白的 HEK293T 细胞。右：左侧免疫印迹的相应量化。这些值代表平均值 ± SD (n =3)。使用学生 t 检验确定统计显着性。 **** p < 0.0001。 (C) 表达刺突蛋白的 HEK293T 细胞中 DNA 损伤修复相关蛋白的免疫印迹。 (D) 暴露于 10Gy γ 辐射的 E.V 和表达刺突蛋白的 HEK293 细胞中 53BP1 病灶形成的代表性图像。比例尺：10 µm。(E) 每个细胞核 53BP1 病灶的定量分析。这些值代表平均值± SEM，n = 50。(F) 暴露于 10 Gy γ 辐射的表达空载体和刺突蛋白的 HEK293 细胞中的 BRCA1 病灶形成。比例尺：10 µm。 (G)。每个细胞核的 BRCA1 病灶的定量分析。这些值代表平均值 ±SEM，n = 50。使用学生 t 检验确定统计显着性。 **** p<0.0001。
3.4. Spike蛋白损害 V(D)J 体外重组
DNA 损伤修复，尤其是 NHEJ 修复，对于 V(D)J 重组至关重要，这是 B 和 T 细胞免疫的核心 [9]。迄今为止，已经基于全长刺突蛋白开发了许多已批准的 SARS-CoV-2 疫苗，例如 mRNA 疫苗和腺病毒-COVID-19 疫苗 [25]。尽管 SARS-CoV-2 是否直接感染淋巴细胞前体尚有争议 [26,27]，但一些报告表明，受感染的细胞会分泌外泌体，可以将 SARS-CoV-2 RNA 或蛋白质输送到靶细胞 [28,29]。我们进一步测试了刺突蛋白是否减少了 NHEJ 介导的 V(D)J 重组。为此，我们根据之前的研究 [18] 设计了一个体外 V(D)J重组报告系统(图 S5)。与空载体相比，刺突蛋白过表达抑制了该体外报告系统中 RAG 介导的 V(D)J 重组(图 4)。
图 4. Spike蛋白在体外损害 V(D)J 重组。 (A) V(D)J 报告系统的示意图。 (B) 流式细胞术的代表性图显示 SARS-CoV-2 刺突蛋白在体外阻碍 V(D)J 重组。 (C) 相对 V(D)J 重组的定量分析。这些值代表平均值 ± SD，n = 3。使用 Student t 检验确定统计显着性。 **** p < 0.0001。
4. 讨论
我们的研究结果提供了刺突蛋白在体外劫持 DNA 损伤修复机制和适应性免疫机制的证据。我们提出了一种潜在机制，通过该机制，刺突蛋白可能通过抑制DNA 损伤修复来损害适应性免疫。尽管尚未发表证据表明 SARS-CoV-2 可以感染胸腺细胞或骨髓淋巴细胞，但我们的体外V(D)J 报告基因检测表明，刺突蛋白强烈阻碍了 V(D)J 重组。与我们的结果一致，临床观察还表明，COVID-19 导致严重疾病或死亡的风险随着年龄的增长而增加，尤其是风险最高的老年人 [22]。这可能是因为 SARS-CoV-2刺突蛋白会削弱老年人的 DNA 修复系统，从而阻碍 V(D)J 重组和适应性免疫。相比之下，我们的数据提供了关于刺突蛋白亚基参与 DNA 损伤修复的有价值的细节，表明基于刺突的全长疫苗可能会抑制 B 细胞中 V(D)J 的重组，这也与最近的研究表明，与基于 RBD 的疫苗相比，基于全长刺突的疫苗诱导的抗体滴度较低 [28]。这表明使用刺突的抗原表位作为 SARS-CoV-2 疫苗可能比全长刺突更安全、更有效。总之，我们确定了 SARS-CoV-2 抑制宿主适应性免疫机制的潜在重要机制之一。此外，我们的研究结果还暗示了全长基于尖峰的疫苗。这项工作将提高对 COVID-19 发病机制的理解，并为设计更有效、更安全的疫苗提供新的策略。（参考部分未展示）
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2021-11-23 18:34:18
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2021-11-23 18:03:57
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