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Thapsigargin是主要人类呼吸道病毒的广谱抑制剂：冠状病毒，呼吸道合胞病毒和A型流感病毒点击：查看上部分内容介绍图1. thapsigargin（TG）在无细胞毒性水平下短时间（30分钟）暴露于人细胞，迅速引起延长的（≥48h）抗病毒状态，从而阻止了RSV复制。 TG在（A）感染前24小时或（B）感染后24小时以剂量依赖性方式引发，可阻止RSV产生。（A）用TG或对照DMSO灌注HEp2和A549 30分钟，用PBS洗涤并在RSV感染前在正常培养基中孵育24小时，或（B）首先在TG 30分钟之前用RSV感染24小时启动。 TG诱导的抗病毒状态持续至少48小时。如图所示，用TG或DMSO对照将HEp2（C）和A549（D）细胞灌注30分钟，用PBS洗涤，再进行24或48小时的正常培养；之后，细胞被RSV感染。所有细胞均以0.1 MOI感染RSV（A2株，ATCC VR-1540），共3天。收集离心的上清液感染HEp2细胞24小时，用小鼠抗RSV（2F7）抗体（pfu / mL）免疫检测RSV。2向ANOVA（Sidak的多次比较）的意义与相应的DMSO控件有关。与A549细胞相比，HEp2细胞更易于RSV复制。 TG抑制RSV转录。在RSV感染之前，立即用0.5µMTG灌注HEp2细胞（E）30分钟，在RSV感染之前（F）用TG灌注HEp2细胞30分钟，用PBS洗涤并培养48小时。总共感染3天后，提取总RNA进行cDNA转换，以量化标准化为18srRNA的病毒基因（L基因，M基因和F基因）表达。通过相对于相应DMSO对照中表达的未配对t检验确定显着性。（G）用指定浓度的TG或DMSO对照预孵育30分钟的（Hp2和（H）A549细胞）用PBS洗涤，在无血清培养基（Opti-MEM）中培养过夜，并进行细胞活力测定（CellTiter-Glo®发光细胞活力测定试剂盒，Promega）。水平条=平均值（红色）±标准偏差；ns =不重要。与Dunnett进行多次比较的单向方差分析的意义是相对于相应的DMSO控件而言的。所有测定均一式三份，进行三次。 *p <0.05和**** p <0.0001。图2. TG作为抗病毒药比利巴韦林更有效，显示出高选择性指数并阻止病毒转录和病毒蛋白产生。如前所述，在培养基中或在单独培养基中连续存在利巴韦林时，将HEp2细胞用TG，利巴韦林或DMSO对照引发30分钟，如前所述用PBS洗涤并用RSV感染（用于TG或DMSO对照）。以4 dpi收获培养基，用于（A）子代病毒滴定（pfu /mL）和（B）通过一步反转录-qPCR检测病毒L基因RNA。除非另有说明，否则单向ANOVA（Tukey的多次比较）的显着性是相对于DMSO控件而言的。在HEp2细胞的RSV感染中，TG的相应选择性指数（SI）估计为984（C，D）。在TG的感染前引发范围内，分别通过pfu / mL病毒滴定和发光细胞活力测定法确定HEp2细胞中TG对RSv的有效浓度（EC）和细胞毒性浓度（CC）。 SI = CC50 / EC50 = 63.43 / 0.06447 = 983.9。 EC90 = 84.55 nM。如图所示，用TG或DMSO对照引发NHBE细胞30分钟，用PBS洗涤并以0.1 MOI感染RSV。在48 hpi时，通过一步反转录qPCR（E）收集用于检测病毒L基因RNA的培养基，提取总RNA进行cDNA转化以定量病毒基因的表达（L基因，F -基因和M基因）标准化为18s rRNA（F）。单向ANOVA（Dunnett的多重比较）（E）和两向ANOVA（Tukey的多重比较）（F）的意义与DMSO控件有关。 TG还抑制NHBE细胞中病毒F蛋白的产生。如图所示，用TG或DMSO对照灌注细胞30分钟，用PBS洗涤，并在80℃下用RSV感染 0.05 MOI持续48小时，并直接免疫染色是否存在RSV F蛋白（G，H）。以100倍放大率拍摄的图像。随着TG启动剂量的增加，RSV阳性细胞（pfu）的数量明显减少。单向方差分析（Dunnett的多次比较）的意义与DMSO控件有关。 * p <0.05，*** p <0.001和**** p <0.0001。图3. NHBE细胞的TG引发增加了ER应激基因的表达（感染前和感染后）和RIG-I信号传导相关基因的基础表达，但是在感染过程中，RIG-I关联基因的诱导是衰减。用TG或DMSO对照引发细胞30分钟，用PBS洗涤并在0.05 MOI下用RSV感染48小时，然后提取总RNA进行cDNA转化以定量ER应激基因的表达（A）DDIT3，（B）HSPA5 （C）HSP90B1。将表达标准化为18s rRNA，通过2向ANOVA（Sidak的多次比较）确定的显着性相对于相应的DMSO对照。有一致的迹象表明，TG启动引发了RIG-I相关基因RIG-I（D），IFNB（E）（以及相应的IFNB蛋白（F））和RNASEL（G）的感染前激活。在16hpi对上清液进行IFNB ELISA。将所有RNA表达标准化为18s rRNA，并通过单向ANOVA和Dunnett的多重比较（D）或2向ANOVATukey的多重比较（E–G）确定的显着性相对于相应的DMSO对照。所有测定均一式三份，进行三次。*p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001和**** p<0.0001。图4. TG抑制OC43病毒的转录和蛋白质的产生，作为抗病毒剂比羟氯喹和瑞姆昔韦更有效，并且显示出高选择性。（A，B）用TG引发A549细胞30分钟，用PBS洗涤两次，并在0.5MOI下用OC43感染3小时。然后，将细胞再次用PBS洗涤，并在无血清培养基（补充有0.1 µg / mL TPCK胰蛋白酶的Optii-MEM）中培养48小时，然后从（A）培养基和（B）细胞中提取RNA，分别进行反转录qPCR和cDNA转换，再进行qPCR，以检测病毒OC43复制酶多蛋白1ab RNA。 cDNA定量标准化为18s rRNA。（C）使用重复的孔组进行细胞蛋白提取，以通过蛋白质印迹法检测OC43 NP。（D，E）如图所示，用TG，羟氯喹（HC）或DMSO / PBS对照对MRC5细胞进行预处理，持续30分钟，用PBS洗涤两次，用OC43（0.01 MOI）感染3 h，再用PBS两次，最后在无化合物（感染前）或持续存在HC（连续）的情况下用无血清培养基补充。在2 dpi时，收集培养基用于（D）通过一步反转录qPCR检测病毒多蛋白1abRNA和（E）通过感染A549细胞24小时并免疫染色是否存在病毒NP来直接检测子代病毒。以100倍放大率拍摄的图像。所指示的显着性（通过单向方差分析确定）和病毒RNA检测的降低百分比相对于相应的对照。（F，G）TG在阻止OC43（F）和甲型流感病毒（G方面优于伦德韦（RDV））复制。用指示的TG，0.3 µM RDV或DMSO对照对A549细胞进行初次免疫30分钟，用PBS洗涤两次，并用0.01 MOI的CoVOC43或1.0 MOI的苏联H1N1病毒感染2小时，然后再次用PBS，然后在无血清培养基中孵育TG引发的细胞，或在连续存在RDV的培养基中孵育。在24、48和72 hpi时，基于相对Ct方法，对收集的上清液进行病毒RNA提取，然后进行一步反转录qPCR，以检测OC43复制酶多蛋白1ab RNA或流感M基因RNA的相对拷贝数。。所指示的显着性是相对于基于2通ANOVA Dunnett（F）或Tukey（G）多重比较测试的RDV处理过的细胞而言的。（H）RDV和TG处理对细胞活力没有不利影响。将A549细胞用RDV连续处理，或用指定的TG或DMSO处理30分钟，洗涤，培养过夜，然后进行细胞活力测定（CellTiter-Glo 2.0细胞活力测定，Promega）。通过单因素方差分析相对于DMSO对照确定指示的显着性。（I）TG对OC43的抑制作用的选择性指数（CC50 / EC50）估计在7072和9227之间。EC90= 0.02622 µM。用TG（0至91 µM）灌注MRC5细胞30分钟，用PBS洗涤两次，并在含10％FCS和1％P / S的DMEM Glutamax中培养过夜。用CellTiter-Glo 2.0细胞活力测定（Promega）进行细胞活力测定（CC50）。有效或抑制TG的剂量反应（EC50）是基于以指定浓度的TG（0至0.5 µM）灌注MRC5细胞30分钟，然后进行PBS洗涤和以0.01 MOI的OC43感染。感染后三天，收集上清液用于RNA提取和一步反转录qPCR以定量病毒RNA（多蛋白1ab RNA）的存在。 CC=细胞毒性； EC =有效浓度。 ** p <0.01，*** p<0.001和**** p <0.0001。接下来，评估了在OC43病毒感染之前和期间对TG启动的ER应激反应。在A549细胞中，TG以剂量依赖性方式基础上和在感染过程中刺激ER应激基因的表达。 TG诱导的A549细胞OC43感染的ER应激基因图谱（图5A，C）与NHBE细胞的RSV感染的TG应激基因图谱高度相似（图3A，C）。在A549细胞中，TG启动似乎对RIG-I相关基因（RIG-I，IFNB和OAS1）的基础转录几乎没有影响。像在NHBE细胞的RSV感染中（图3D，G）一样，在TG引发的细胞的OC43感染过程中，RIG-I相关基因的诱导也减弱了（图5D，F）。因此，在OC43感染期间降低RIG-I相关基因的转录诱导也是TG介导的OC43病毒抑制的特征。重要的是，感染前TG引发的A549细胞与OC43病毒和苏联H1N1甲型流感病毒的共同感染（图5H）一样，能够抑制单独的病毒感染（图5G）。总之，A549细胞的TG引发在基础上和OC43感染期间增加了ER应激基因的表达，在感染期间减弱了RIG-1信号相关基因的诱导，并抑制了与OC43和流感病毒的共感染。 1.1. TG阻止子代SARS-CoV-2生产 SARS-CoV-2与OC43病毒一样易受TG抑制。用TG对Calu-3和NHBE细胞进行感染前预感染可阻断SARS-CoV-2复制（图6A，C），这与在A549和MRC5细胞中用OC43病毒所见的抑制作用相当（图4A，D）。在Calu-3细胞中，用SARS-CoV-2在TG感染24小时后用TG引发感染后30分钟也有效抑制病毒，表明其在SARS-CoV-2感染中具有治疗潜力（图6B）。与流感病毒抑制一样[14]，TG无法抑制SARS-CoV-2在Vero E6细胞中的复制，这表明完整的I型IFN系统对于TG介导的宿主抗病毒应答是必需的（图6D）。通过子代病毒RNA检测（图6E–H）和传染性子代确定，TG的广谱抗病毒效力在单独的病毒感染中与在SARS-CoV-2和pdm H1N1病毒共感染中一样明显在感染的Calu-3细胞的培养基中通过TCID50分析检测病毒（图6I–K）。在72 hpi下，在单个病毒中，相对于相应的DMSO对照，0.5 µM TG引发的细胞相对于相应的DMSO对照，抑制SARS-CoV-2后代病毒产生300倍（99.7％）和880倍（99.9％）。感染（图6I）和共同感染（图6J）。相对于相应的DMSO对照，在以0.5 µM TG引发的共感染细胞72 hpi时，pdmH1N1病毒的产量降低了11倍（93.3％）（图6K）。总体而言，在单病毒比较（图6E，F）和共感染（图6G，H）中，SARS-CoV-2与dd H1N1病毒感染相比，TG引发的后代病毒减少比例更高。这表明SARS-CoV -2比dm H1N1病毒对TG抑制更敏感。总之，TG是一种广谱抗病毒药物，主要针对人类主要呼吸道呼吸道合胞病毒，冠状病毒（特别是SARS-CoV-2）和甲型流感病毒，不能区分单病毒感染和复合病毒感染。图5. A549细胞的TG引发在基础上和在OC43感染期间增加了ER应激基因的表达，在感染期间减弱了RIG-I信号相关基因的诱导，并抑制了与OC43和流感病毒的共感染。（A–C）。TG引发似乎以剂量依赖的方式刺激内质网应激基因的表达。（D–F）TG在感染过程中减弱了RIG-I相关基因的诱导。 A549细胞用TG引发30分钟，用PBS洗涤两次，并在0.5 MOI下用OC43感染3小时；此后，再次用PBS洗涤细胞，并在无血清培养基中培养24小时，然后收集细胞裂解液用于RNA提取和cDNA转化，用于（A）DDIT3，（B）HSPA5，（C）HSP90B1，（D ）RIG-1，（E）IFNB和（F）OAS1。将所有表达标准化为18s rRNA。意义相对于基于2向ANOVA（Tukey的多次比较）的相应DMSO控件。（G，H）在单独的病毒感染或共同感染中，TG在A549细胞中抑制了OC43病毒和苏联H1N1病毒的复制。将细胞用TG灌注30分钟，用PBS洗涤两次，并在OC43病毒和OC43病毒和US H1N1病毒感染下单病毒感染或共同感染3 h分别为0.01和1.5 MOI（基于FFA）；之后，将细胞再次用PBS洗涤两次，并在无血清培养基中孵育。在48 hpi收获培养基用于病毒RNA提取，然后进行一步反转录qPCR，以检测OC43复制酶多蛋白1ab RNA和苏联H1N1 M基因RNA的相对拷贝数。所示的显着性基于2次方差分析Tukey的多次比较，并且病毒RNA检测的减少百分比相对于相应的DMSO对照。所有测定均一式三份，进行三次。 * p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001和**** p <0.0001。图6.在单病毒感染和与pdm H1N1病毒共感染中，TG有效地阻止了子代SARS-CoV-2的产生。（A，C，D）Calu-3和NHBE细胞的感染前TG引发，但不是Vero E6细胞，有效地抑制了子代病毒的输出。按照指示用TG灌注细胞30分钟，用PBS洗涤两次，并在80℃下感染SARS-CoV-2。 0.01MOI 3小时；之后，将细胞再次用PBS洗涤两次，并在无血清培养基中孵育，该培养基中添加了0.2 µg /mL TPCK胰蛋白酶。在72 hpi的培养基上进行病毒RNA提取。（B）在24 hpi用TG引发阻断了SARS-CoV-2在Calu-3细胞中的复制。首先以0.01 MOI的浓度将SARS-CoV-2细胞感染细胞24小时，然后用指示的TG灌注30分钟，用PBS洗涤3次并在无血清培养基中孵育。在48和72 hpi的培养基上进行病毒RNA提取。根据相对Ct方法，对以上分离的所有RNA进行一步反转录qPCR，以检测SARS-CoV-2复制酶多蛋白1ab RNA的相对拷贝数。用TG对Calu-3细胞进行预感染引发可抑制（E）SARS-CoV-2和（F）pdm H1N1病毒的单独感染，以及（G，H）两种病毒的共同感染。用TG或DMSO灌注细胞30分钟，用将相应的病毒以0.01 MOI的浓度持续2 h，用PBS洗涤3次，然后在无血清培养基中孵育。在感染后指定的时间点，对感染细胞的培养基进行采样以进行病毒RNA提取，以进行一步反转录qPCR，以检测SARS-CoV-2复制酶多蛋白1ab RNA（E，G）和流感的相对拷贝数M基因RNA（F，H）。（IK）在相似感染的培养物上于24、48和72 hpi采集的培养基样本用于检测通过在Vero细胞中进行TCID50病毒滴定来检测存活的子代病毒（显示为平均值±SEM）。（一）在单病毒感染中 SARS-CoV-2，TG表现出剂量依赖性病毒抑制作用。在与SARS-CoV-2和pdm H1N1病毒共感染时，TG能够同时抑制SARS-CoV-2（J）和pdm H1N1病毒（K）。所示的显着性基于2向ANOVA Tukey的多次比较测试和相对于相应DMSO对照的病毒RNA变化百分比。 * p <0.05，** p<0.01和**** p <0.0001。 3.4. TG甲型流感病毒的翻译后阻断可在致命病毒攻击中保护小鼠我们先前发现TG抑制NHBE细胞和NPTr细胞中流感病毒复制的过程中，病毒NP和M1蛋白的病毒转录或产量几乎没有或没有变化，表明该病毒在翻译后被阻断了[14]。由于病毒NP和M1蛋白在胞质核糖体上被翻译成核输入，因此我们在这里检查了通过ER-高尔基体运往宿主细胞膜的病毒蛋白（HA，NA和M2）[25]。来自TG引发的NPTr细胞的病毒蛋白分析（图7A，B）显示，所有其他病毒蛋白的表达似乎也未受影响，这表明TG差异性靶向了流感病毒，RSV和冠状病毒的复制周期。由于TG的抗病毒作用在酸性pH值而不是在碱性pH值下稳定（图7C，D），因此在小鼠致命流感病毒攻击中评估了TG的口服治疗（感染后）功效。组中的每只BALB / c小鼠（每组n = 8）首先经鼻内感染3种MLD50的PR8 / H1N1病毒，第二天每天一次通过管饲法给予TG或oseltamivir，持续5天。低口服剂量TG（根据经验选择1.5 µg / kg /天）所赋予的保护作用与高剂量奥司他韦（45 mg / kg /天）对小鼠的保护作用相似。在治疗上，与PBS-PBS相比，TG治疗组的存活率显着提高（图7E），感染后3天和5天（dpi）的病毒脱落减少（图7F），体重减轻程度较轻（图7G，H）。 DMSO控制。七只，八只和两只小鼠全部在TG，奥司他韦和PBS +DMSO组中存活。在所有三个参数中，用TG和奥司他韦治疗的小鼠之间没有显着差异。因此，口服TG在遭受致死性流感病毒攻击的小鼠中赋予治疗保护。图7. TG在翻译后抑制甲型流感病毒，对酸稳定，在致命病毒攻击中具有治疗性保护小鼠的作用。（A）由TG引发的NPTr细胞引起的流感后代产量急剧下降是（B），同时病毒蛋白没有下降。将细胞用TG灌注30分钟，用PBS洗涤两次，并以0.5 MOI的浓度感染USSR病毒2小时。之后，将细胞再次用PBS洗涤3次，并在无血清培养基中温育24小时，该培养基中添加了0.2 µgl /mL的TPCK胰蛋白酶。（A）用相应的培养基样品进行聚焦形成测定，以确定活病毒的产量（ffu / µL）。所示的显着性基于单向ANOVA（Dunnett的多重比较）和相对于相应DMSO对照的存活子代百分比。（B）病毒蛋白，包括通过ER-高尔基体处理的蛋白（HA，NA和M2），未显示TG引发的细胞减少。（C，D）TG的抗病毒活性在酸性但不是碱性条件下是稳定的。（C）首先，将所用的TG首先按照指示在pH 1.5（在30mM盐酸中）孵育不同的时间，并用氢氧化钠中和，然后以0.5 µM的终浓度应用于细胞中30分钟。（D）首先将所用的TG在pH12.0（10 mM氢氧化钠）中孵育2小时，并用盐酸中和，然后以0.5 µM的最终浓度将其应用于细胞30分钟。在以0.5 MOI的感染率感染苏联H1N1病毒后二十四小时，将感染的培养基用于6小时聚焦形成试验，以免疫检测病毒NP以确定子代病毒的产量（ffu/ µL）。除非另有说明，否则重要性基于单向ANOVA Tukey的多重比较，并且病毒减少的百分比与相应的DMSO控件有关。（E–H）TG在小鼠致命流感病毒攻击中的治疗保护。组中的每只BALB / c小鼠（每组n= 8）都经鼻内感染了3种MLD50的PR8 / H1N1病毒。然后每天给每只小鼠口服一次TG（1.5 µg / kg /天），奥司他韦（45mg /kg /天）或PBS + DMSO，持续5天；第一次剂量为12 hpi。在14d内记录生存率（E），通过TCID50分析的肺病毒滴度（F）和体重变化（G，H）。每个时间点代表平均值±SEM。 Kaplan–Meier方法用于生存分析。相对于相应的TG组显示了显着性。 * p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001和****p<0.0001。点击：查看文章结论查看更多冠状病毒文章查看更多医学文章试用免费文档翻译功能免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网站无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。来源于：mdpi

2021-02-24 16:25:25

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冠状病毒

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