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在活细胞中研究RNA与蛋白质相互作用的动力学

在活细胞中研究RNA与蛋白质相互作用的动力学

生物学 细胞研究 全文翻译
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2021-03-04 19:04:08


了解生物分子在细胞中结合和解离的速度对于建立生物学定量模型至关重要,但是直到现在,才可以使用体外纯化的蛋白质来测量这些动力学。

正如遗传学家Theodosius Dobzhansky在1973年指出1时,“除了进化,生物学上没有任何意义。” 许多现代生物学家可能会补充说,除了从生物化学的角度来看,分子生物学没有任何意义-如果没有生物化学提供的定量理解,生物学家如何预测生物体早期发育过程中蛋白质水平降低两倍的影响,还是癌细胞中另一种蛋白质的浓度增加了十倍?长期以来,简化的生物化学实验与混乱的细胞之间的鸿沟似乎无法克服。现在,Sharma等人在《自然》杂志上撰文2个 报告了一种能够对细胞中的分子相互作用进行生化分析的技术。

作者专注于RNA分子与蛋白质之间相互作用的动力学。信使RNA分子与各种RNA结合蛋白(RBP)结合,这些蛋白控制着mRNA生命周期的几乎每个方面-从最初加工的RNA到最终的破坏3。每个RBP可以结合数百个RNA分子,每个RNA可以被数十种不同的RBP 4结合。此外,RNA-蛋白质相互作用不是静态的56。取而代之的是,蛋白质可以快速结合至其靶RNA,并与它们迅速解离(图1),而这些动力学是基因调控的核心。换句话说,RNA-蛋白质相互作用的动力学是基因表达的驱动力。因此,定义细胞中这些动力学的参数对于充分理解基因表达的调控至关重要。


一种探测细胞中RNA与蛋白质相互作用的方法。.png

 


1 | 一种探测细胞中RNA与蛋白质相互作用的方法。作用于RNA分子的蛋白质会迅速与其靶结合位点缔合和解离。为了定量地了解基因调控,需要测量缔合和解离的速率,但是在活细胞中不可能做到。Sharma等。2描述了一种称为KIN-CLIP的方法,该方法使用紫外线的超快脉冲在细胞中的结合蛋白与RNA分子之间产生共价交联。这不仅可以鉴定蛋白质的RNA靶标(如先前报道的交联技术中可能的那样),而且由于交联过程的快速性,还可以确定缔合和解离的动力学。

尽管已经研究了RNA与蛋白质的相互作用数十年,但尚未对其在细胞中的动力学进行表征。广义上讲,动力学见解只能从使用纯化蛋白的体外研究中获得。在细胞中的实验已经能够识别RBP的RNA目标,但缺乏测量相互作用动力学的精度5。随着高通量测序方法的出现,体外方法现在可以探测蛋白质与成千上万个RNA变体7相互作用的动力学。但是这些实验仍然在没有细胞环境的情况下对纯化的蛋白质进行。在过去的几年中,一种称为交联和免疫沉淀的方法8CLIP)已成为表征细胞中RNA与蛋白质相互作用的主要工具。在CLIP中,使用紫外线将与RNA分子复合的蛋白质共价交联到RNA上。然后分离复合物,并通过高通量测序鉴定交联的RNA。这种方法提供了在复杂细胞环境中与特定RBP结合的RNA的目录,但充其量只能提供这些相互作用的快照。

Sharma和他的同事现在弥合了体外之间的鸿沟通过开发一种可以确定细胞中RNA与蛋白质相互作用的动力学参数的CLIP的策略和CLIP。作者的主要见解是,先前报道的CLIP方法的某些技术方面使此类方法无法用于捕获动力学参数。最具挑战性的限制是,交联速率必须快速以捕获蛋白质和RNA分子缔合和解离的速率。常规的UV源无法实现足够快速的交联,因此使用它们来测量动力学就像使用慢速快门拍摄奔腾的骏马-图像中的所有东西都模糊在一起。这一认识促使作者使用脉冲飞秒紫外线激光器,该激光器将蛋白质交联到RNA的速度足够快,可以捕获动力学参数。

为了测试该方法,作者将其应用于名为Dazl的RBP,这是生产生殖细胞所必需的,并调节基因表达9Dazl结合数百个目标mRNA,增加其稳定性和产生的蛋白质数量10。然而,尽管其具有生物学重要性,但关于Dazl的结合和功能的许多知识仍未知,这使其成为KIN-CLIP实验的理想候选者。

Sharma和同事首先验证了KIN-CLIP可以识别从“快照” CLIP生成的先前发布的数据集中发现的RNA靶标。然后,他们计算了Dazl与RNA中数千个结合位点的缔合和解离的动力学参数,称为速率常数。这些结果表明,Dazl结合是高度动态的:其结合时间短;RBP仅驻留在各个站点几秒钟。Dazl也很少结合,因此在大多数情况下,结合位点都不含蛋白质。

作者还发现,多个Dazl分子倾向于在彼此靠近的位点结合。动力学分析表明,这可能是由于合作结合引起的,这种现象是一种蛋白质与一个位点的结合增加了其他蛋白质与附近位点结合的可能性。最后,作者将新确定的Dazl动力学参数纳入了其对基因表达影响的预测模型中,从而为Dazl的功能提供了生化基础,并为将来的研究奠定了基础。

这项研究最令人兴奋的方面之一是KIN-CLIP在研究其他RBP方面的潜力,但是该方法确实有一些局限性。例如,与所有基于CLIP的技术一样,将目标蛋白质与结合的RNA交联的能力是必需的。这可能具有挑战性,因为某些蛋白质没有正确定向的必要侧链以进行交联。但是,对于潜在的KIN-CLIP转换而言,最大的障碍是交联需要专用设备:对于许多生物学家而言,脉冲飞秒激光可能并不容易获得。此外,KIN-CLIP库的实验过程和相关分析比标准CLIP实验的过程更复杂,并且可能被证明是采用该过程的另一个障碍。

尽管如此,这项研究将生物化学的工具带入了活细胞,并且在此过程中可能为研究RNA与蛋白质的相互作用提供了一个转折点。下一步是将KIN-CLIP应用于其他RBP,但将其应用到其他类型的相互作用生物分子上的前景也已浮出水面。的确,作者们有趣地注意到,脉冲飞秒激光可以使蛋白质与DNA交联-也许“ DNA KIN-CLIP”就可以实现。Sharma及其同事不仅为RNA生物学设定了新标准,还可能更广泛地释放了生物化学对分子生物学的影响。

 

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