3.5. CRC中CMS与PI的比较

　　我们对PI系统和CMS进行了比较分析，国际协会19对CRC的四个亚类进行了描述：CMS1具有超突变，微卫星不稳定和强免疫激活作用;带有WNT和MYC信号激活的CMS2;CMS3具有明显的代谢失调;以及具有TGF-β激活，基质侵袭和血管生成的CMS4。当在CIT队列中将CMS与PI系统进行比较时，CMS4中的大多数患者(126名中的116名，占92.1%)，其中CRC患者具有明显的无复发和总体生存较差的特征，并且往往被诊断为PI将更高级的阶段(III和IV)19归类为高风险(补充图S4a)。在CMS中，CMS1中40.4%(89例中的36例)患者与免疫逃逸的激活和较高的组织病理学分级有关，也被PI归为高危亚组。尽管CMS4和CMS1，CMS2和CMS3高风险CRC患者占主要地位，但与其他亚型相比，低风险CRC的患病率更高：高风险CRC的35.6%(230的82)和24.2%(66的16)分别包括在CMS2和CMS3中(补充图S4a)。当按PI评分对患者进行分类时，得分较高的CRC患者倾向于按CMS4分类(图5)。(图4a)，4a)，表明由PI分层的高风险亚组可以很好地反映CRC的分子亚型，显示出从上皮-间充质转化(EMT)19带来的不良预后。

图4根据11个基因签名和4个衍生自共有分子分子亚型(CMS)的亚型，按预后指数(PI)分层的亚组的比较。

　　PI在(a)CIT，(b)AUS和(c)AMC队列中显示基因表达模式。红色和绿色分别反映了高和低的表达水平

　　我们还将CMS联盟提供的CMS分类器应用于来自AUS队列的基因表达数据。与CIT队列相似，绝大多数CMS4患者是高危CRC患者(60名中的45名，占75%;补充图S4b)。我们还观察到，CMS1亚组中包含许多高危CRC患者(51个中的23个，占45.1%)，而CMS2和CMS3包含的CRC高危患者较少(17.3%(75个中的13个)和7.5%(3) (分别为40)分别与CIT队列中的CMS分类保持一致(补充图S4b)。根据PI评分对患者进行分类时，许多得分较高的CRC患者被归类为CMS4(图2)。(图4b)，4b)，验证PI分类的预后相关性可作为CRC患者预后不良的指标。

　　使用构成PI系统的11个基因签名，我们还为AMC队列中的每个患者计算了PI。当PI将AMC队列中的患者分为低风险或高风险亚组时，两种风险亚型之间的疾病复发频率显着不同(Fisher精确检验，P  <0.001，优势比= 4.759，95% CI = 1.78–8.64;图图4c)，4c)，与使用1160个系统性复发相关基因的分层聚类分析相一致(图。 (图。1)。1个)。比较亚组之间的11个基因的表达水平，我们观察到这些基因有显着差异(两次样本t检验，每个P  <0.05;补充图S5)。我们还将CMS分类器应用于AMC队列中的RNA-seq数据。检查参与CMS亚组的PI分类高风险CRC患者的频率时，我们获得的比例分别为31%(29个中的9个)，44.1%(59个中的26个)，50%(18个中的9个)和87.5% CMS1，CMS2，CMS3和CMS4子组中分别包含的百分比(24个中的21个)高风险CRC，与CIT和AUS队列相比，表明CMS4中有类似的高风险患者受累(补充图S4c)。通过PI分类的许多高分率CRC患者显然与CMS4相关，尽管其他CMS亚组中的许多患者被预测为系统性复发的高风险CRC(图。(图4c4c)。

　　最后，我们比较了PI和CMS分类器之间的基因。基于随机森林预测模型19比较PI系统中的11个基因和CMS分类器中的273个基因时，有趣的是，尽管PI评分高的CRC患者与CMS4的预后相似，但在两个基因列表之间未发现共有基因。亚组。

4. 讨论

　　大规模高通量技术的广泛进步为CRC提供了许多见解。除了在CRC分子亚型的各种调查，13，23 - 25，由一个国际财团与聚集先前报道亚型努力达成共识也有报道19旨在揭示肿瘤的异质性，并为CRC提供适当的治疗选择。尽管进行了这些严格的努力，但仍很少有可靠的生物标记物可用于准确预测CRC的疾病复发，这是处理或治疗CRC患者的未满足需求之一。在这里，我们收集了总计130例有或没有系统性复发的原发性CRC，并基于RNA-seq分析生成了转录组数据集。通过基因表达谱分析和途径富集分析，我们确定了127个系统性复发相关基因。在这些基因中，有11个基因AK2，BID，CDC25A，EIF4A2，HSPB1，ITGB1，MAP4K4RT-PCR分析证实，MMP12，PTGES3，RHOC和TERF2IP是与多个患者队列中CRC无复发生存相关的最佳特征。PI与这11个基因结合在一起，可强烈预测高风险CRC，并且独立于当前可用的临床指标。生存结果强调了III期CRC患者的预后潜力以及II期CRC患者辅助化疗的特异性。

　　由于一半的CRC病例与致命事件有关，因此迫切需要对复发或转移进行预测。在这方面，我们认为分子驱动方法将导致易于复发的CRC患者的识别和个性化的治疗选择，通过减少系统性复发来提高生存率。最近，CRC子分类协会(https://github.com/Sage-Bionetworks/crcsc)将六个独立的分类器划分为四个CMS。同样，我们根据当前的PI标准对高危亚组的结果显示，与其他相比，CMS4(间质型)的总体生存率和无复发生存率较差，而CMS1(MSI免疫型)的复发后生存率较差。亚型19。尽管几项随访研究得出了相应的结果，但另一项研究警告说，未考虑肿瘤异质性的各个亚型可能导致将患者分为不适当的亚组26。但是，已经研究了单个或多个标记子集，以阐明CRC中的复发预测因子。MACC1过表达通常导致差的存活结果和被识别为在CRC复发的患者的独立预后指标19，27。

尽管对CRC进行了广泛的研究，但由于CRC的异质性，仍然很难确定将从辅助化疗获益最大或最少的患者。辅助化疗的优势已经确立患者的AJCC III期癌症的21，22，而其在AJCC阶段成效II患者仍存在争议5。在本研究的几个子集分析中，PI系统显示了II期和III期CRC患者的强大预后价值，以及II期CRC患者辅助化疗的显着预测价值。在这项研究中，PI评分可以确定患有II期CRC的低危患者亚组，这些亚组将从辅助化疗中受益。在交互作用分析中，如PI预测，对于低危亚组的患者，化疗与II期密切相关，并且与较差的结果显着相关，而对于高危组的患者，化疗的效果并不明显。 II期疾病。一线化疗显然对PI低表达的II期肿瘤的疗效不及所有其他亚组。因此，其他疗法，包括针对性的生物制剂，

　　目前提出的PI系统是由11种基因的表达水平组合产生的，这11种基因的表达与CRC的发生和发展密切相关。AK2编码的蛋白质是在线粒体28的膜间空间中发现的一种酶。在人类中AK2缺乏引起的造血缺陷和免疫缺陷29，30。BID，一种BH3相互作用域死亡激动剂，编码一种蛋白质，该蛋白质是细胞死亡调节剂BCL-2家族的成员，其是caspase-8诱导的线粒体损伤的介体。出价在细胞中还具有许多主要活性，例如凋亡，细胞死亡，活化或增殖。虽然之间几个关联BID和癌症已经研究，评价和评估BID在人结肠疾病，如结肠直肠腺瘤或结肠炎，已经证明31，32，这表明BID可以是CRC的一个可能的调节。CDC25A，细胞分裂周期25A，在响应DNA损伤后特别降解，导致细胞周期停滞和成纤维细胞与致癌RAS 33相互作用的转化。EIF4A2编码蛋白，真核翻译起始因子4A II，它是EIF2信号传导途径中蛋白质合成起始过程中eIF4F复合物的组成部分。尽管少数细胞功能EIF4A2已经发现，之间的正关联EIF4A2和各种癌症，包括CRC，已经研究34，35，这表明EIF4A2可以是CRC复发的一种新颖的介体。ITGB1编码的蛋白质(Integrin beta-1)是一种膜受体，参与多种过程中的细胞粘附和识别，包括胚胎发生，止血，组织修复，肿瘤细胞的免疫应答和转移扩散。描述ITGB1与各种癌症(例如胃癌36，乳腺癌37和肺癌38)之间显着正相关的大量研究清楚地支持了ITGB1在癌症中的侵略性特征。的先前报道的功能角色ITGB1在CRC细胞系，如细胞粘附39，40，增殖41，细胞凋亡42，和磷酸化43，显然支持ITGB1对CRC侵略性的贡献。MAP4K4编码蛋白MEK激酶激酶4，它与多种生理过程有关，包括细胞迁移，增殖和粘附。CRC的不良预后和疾病进展与MAP4K4表达水平密切相关44。RHOC编码小GTP酶的Rho家族的成员(即ras同源家族C)。RHOC也参与mTOR信号通路，其中mTORC2通过Gho加载Rho家族45的蛋白质来调节细胞骨架组织。红十字会过表达与肿瘤细胞的增殖和转移有关，特别是与CRC转移信号通路有关，强调了含PI的RHOC表达的预后价值。在签名的11个基因中，MMP12(基质金属蛋白酶12)，PTGES3(前列腺素E合酶3)和TERF2IP(端粒重复结合因子2相互作用蛋白1)参与某些临床活动46，但它们的临床关联性与CRC的报道很少，这提示这些基因可能是CRC预后的新标记。

　　尽管我们在多个患者CRC队列中研究了我们PI系统的临床相关性，但我们的研究存在一些局限性。由于AMC发现队列中数据的随访时间短，因此无法在该队列中确认签名中11个基因的预后相关性。尽管这些结果说明了II期CRC患者的化学特异性，但接受辅助化疗的患者数量不足以清楚地确定PI系统的化学反应。另外，由于在PCR验证中仅评估了独立患者组中的样品太少，因此难以确定基因的重要性。PI系统应在较大的独立临床队列中进行严格验证，对CRC患者的随访时间较长。

总之，我们确定了由CRC中11个基因的表达所定义的不同预后亚组。作为预后和预测指标，新近确定的PI系统不仅可以识别高危II期和III期CRC患者，还可以预测受益于辅助化疗最少的低危II期CRC患者。但是，对于PI的实际临床应用，需要更复杂，更严格的验证步骤，这些步骤不仅会评估其他更大的患者队列，而且还会通过液体活检来评估可检测性。

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