收到：2021年2月17日受理日期：2021年3月15日出版日期：2021年3月24日发行人注意：MDPI在已发布地图和机构关联中的司法管辖权要求方面保持中立。版权：©2021作者。瑞士巴塞尔的MDPI被许可人。本文是根据知识共享署名（CCBY）许可的条款和条件分发的开放获取文章。 摘要：高通量筛选方法的发展可能会减少对实验动物进行毒性测试的需求。在这里，我们研究了利用美国环境保护局ToxCast计划的高通量筛选数据评估免疫毒性的潜力。作为案例研究，我们分析了添加到食品中的最常见化学物质以及从包装材料或加工设备迁移到食品中的全氟和多氟烷基物质（PFAS）。抗氧化剂防腐剂叔丁基对苯二酚（TBHQ）在ToxCast分析和经典免疫分析中均具有活性，表明它可能会影响人们的免疫反应。从PFAS组中，我们确定了8种可以从食品接触材料中迁移出来的物质，并具有ToxCast数据。在流行病学和毒理学研究中，PFAS会抑制免疫系统并降低对疫苗接种的反应。但是，大多数PFAS在免疫相关的ToxCast分析中均显示弱或无活性。普通PFAS的毒理学和高通量数据之间缺乏一致性，这表明了体外筛选分析免疫毒性的当前局限性。高通量体外试验显示出有望提供与免疫风险评估相关的机械数据的希望。相反，在现有的高通量测定中缺乏免疫特异性活性不能验证化学物质对免疫系统的安全性。 关键词：免疫毒理学；免疫毒理学中的多组学方法；食品添加剂的免疫毒性方面；高通量筛选ToxCast；食品添加剂;食品接触物质；叔丁基对苯二酚；全氟和多氟烷基物质 1. 介绍免疫系统是化学毒性的目标之一。已报告了多种物质的免疫毒性，包括砷化合物[1]，氯化溶剂[2]，农药[3]以及全氟烷基和多氟烷基物质[4]，并且正在发育的免疫系统更容易受到有害物质的伤害。化学暴露与成人免疫系统相比的影响[5-8]。免疫毒理学作为一个领域自1970年代就已经存在[9]，并且专家组已经发布了进行免疫毒性评估的建议[10,11]。免疫毒性定义为暴露于异源物质后免疫系统的适应不良功能。这种现象包括功能丧失（免疫抑制）。过度的，破坏性的免疫反应（免疫增强）；以及可能永久或可逆的免疫反应改变（免疫调节）。物质对免疫系统的影响取决于多种因素，例如接触途径和持续时间以及毒性机制。免疫毒性作用可能以不同的方式表现出来，包括疫苗接种后抗体水平降低，自身免疫症状或全身性炎症[12,13]。对免疫系统对环境污染物的敏感性的认识导致了分析方法的发展，可以评估化学物质的免疫毒性-潜力[14]。免疫毒性分析可以评估免疫系统器官的组织病理学和重量，淋巴细胞计数，血清免疫球蛋白水平细胞介导的免疫反应，抗体产生，自然杀伤(NK)细胞功能和其他功能[10]。观察性免疫毒性测量，例如对特定免疫细胞类型的数量和相对频率的分析，不能提供有关免疫系统如何受化学物质影响的机制数据。功能测试(例如T细胞依赖性抗体应答测定和细胞毒性测定)使免疫毒性评估进一步向前推进了一步。最后，测量抵抗传染病的免疫防御的宿主抗性测定被认为是免疫毒性测试的金标准[15]。考虑到免疫系统的复杂性，没有任何一种测定方法可能足以确定免疫毒性，并且可能需要对不同免疫学终点进行分析组合才能预测免疫毒性[12]。可获得的力学数据可以证实其他证据的发现，例如对实验动物的研究[13]。尽管有用于免疫毒性的测试方法，但这种测试尚未成为化学风险评估中的优先事项。经济合作与发展组织和欧盟化学测试指南包括对免疫系统参数(例如淋巴器官重量，血液学和组织病理学评估)的评估，作为标准口服28天和90天的一部分在实验动物中进行毒性研究，但不需要对制造的化学药品或污染物的免疫毒性进行系统分析[16]。美国环境保护署于1998年发布了农药的免疫毒性测试指南，但后来表示可以免除该测试要求[17,18]。有关化学替代品危害评估的美国EPA环境规划设计标准文件列出了免疫毒性在不太常见的毒性终点中[19]。高通量筛选和组学技术（基因组学，转录组学，蛋白质组学和代谢组学）等新方法方法有望产生有助于化学风险评估（包括免疫毒性评估）的新数据[20,21]。美国EPA ToxCast计划整合了与多种毒理学终点，器官系统和疾病过程相关的高通量筛选分析[22-25]。最近的两项研究对与诱导慢性炎症有关的ToxCast分析进行了分类，这是一种免疫介导的过程[26,27]。但是，仍然需要对免疫相关的ToxCast分析进行系统的评估。由于分子途径的多样性以及参与免疫应答的多种细胞类型和组织的编排，从高通量数据或无动物模型到与免疫系统相关的毒理学终点的转化仍然是一个挑战[28]。在这里，我们调查了根据美国EPA ToxCast计划生成的数据是否可用于免疫毒性筛查。我们专注于食品中存在的物质，包括直接食品添加剂和可以从食品接触材料迁移到包装食品中的物质。2. 材料和方法2.1. 识别免疫相关高通量分析的数据挖掘策略我们的分析结合了来自美国EPA ToxCastCompTox仪表板（https://comptox.epa.gov/dashboard，于2020年9月24日访问）和比较毒物基因组学数据库（http://ctdbase.org，于9月24日访问）的数据。2020）。由美国MDI生物实验室（美国缅因州索尔兹伯里湾）和北卡罗来纳州立大学（美国北卡罗来纳州罗利）的研究人员开发的比较毒物基因组学数据库，是根据PubMed中列出的经过同行评审的文献手动整理的数据库[29， 30]。于2020年9月从比较毒物基因组学数据库网站检索了表型的相互作用，描述为“免疫系统过程”。ToxCast数据集直接从美国EPA CompTox Chemicals信息中心下载，此处引用的所有ToxCast信息均表示可在于2020年9月在美国EPA网站上发布。ToxCast计划包含数百种在不同检测平台下开发的高通量检测方法，包括无细胞检测以及基于细胞的分析[31]。 ToxCast将每种化学物质的测定结果归类为命中的“有效”或“无效”（达到或不满足剂量反应标准）。可在CompTox仪表板中查看模型化的AC50值（最大活性为50％时的活性浓度）。每种化学物质也被分配了一个“细胞毒性极限”，一个计算值反映了ToxCast分析中单个化学物质的整体细胞毒性[31]。细胞毒性极限值并不表示物质在特定测定中的细胞毒性，并且AC50值高于计算出的细胞毒性极限值的测定数据可能具有生物学相关性[27]。在美国EPACompTox仪表板上发布的ToxCast数据建模包括对分析的数据质量标记的分配，例如“低于50％功效”，“仅基线以上最高浓度”，“边界活跃”，“嘈杂数据”和其他标志。基于对本研究中所含化学物质的ToxCast测定图的手动审查，我们集中于两种类型的具有最强响应特异性证据的测定：无数据质量标记的测定和仅具有一个数据质量标记的测定，“小于50％的功效”。在通过案例研究化合物激活的ToxCast分析中，我们确定了针对特定基因靶点的分析（因此不包括测量细胞毒性，增殖或活力的分析），并根据NCBI中列出的信息审查了每个基因的功能基因数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/，于2020年9月24日访问）和PubMed数据库。根据同行评审文献和基因功能摘要中的报道，我们基于目标基因或蛋白质参与先天性和适应性免疫应答将ToxCast分析分类为与免疫系统相关。 2.2. 案例研究化合物的鉴定2.2.1. 直接食品添加剂Karmaus等。 [32,33]检查了美国食品中允许使用的化学物质的范围（美国EPA ToxCast中提供了数据），确定了出于功能目的直接添加到食品中的556种化学物质和可能从食品中迁移到食品中的339种化学物质。包装，加工或清洁化学品。以上子集中的某些化学物质可能被批准用作直接添加剂和用于食品包装。我们从Karmaus等人定义的556种直接食品添加剂清单开始。 [33]以及丁基化羟基茴香醚的添加，后者是一种直接的食品添加剂，用作抗氧化剂防腐剂[34]。为了确定美国食品供应中最常用的添加剂，Karmaus等人的557种直接添加剂的化学名称。[33]与2018年至2020年期间在美国杂货店销售的120,000多种包装食品和饮料产品的标签相匹配。我们研究小组分析的标签数据由LabelInsight提供，LabelInsight是经过验证的产品属性元数据的主要来源。Label Insight的标签数据覆盖率超过了在美国销售的消费品商品的80％（https://www.labelinsight.com/about，于2020年9月24日访问）。2.2.2. 间接添加剂：全氟和多氟烷基物质对于我们对间接食品添加剂的分析，我们将范围缩小至全氟烷基物质和多氟烷基物质（PFAS），食品包装中使用的化学物质，并且对于某些类别的某些成员具有已知的免疫毒性[35]。为了确定报告了哪些PFAS迁移到食物，我们使用搜索查询（“ PFAS”或“氟调聚物”或“含氟化合物”或“全氟烷基”或“全氟化”或“多氟化”或“ PFOA”或“ PFOA” “全氟化物”或“氟化”或“ FTOH”）和（“迁移”或“释放”或“可提取”）和“食物”。此外，还对相关出版物中的参考文献进行了审查，以纳入我们的分析。基于PFAS的食品接触物质也已在美国食品和药物管理局（U.S. FDA）的包装与食品接触物质数据库中进行了审核[36]。 3. 结果3.1. 案例研究化合物的鉴定为了确定可获得高通量ToxCast数据的最常见食品添加剂，我们将557种直接添加剂的清单[33]与2018-2020年在美国销售的产品的成分标签进行了匹配。在这一组中，在成分标签上鉴定出81种物质，并且我们按使用频率对添加剂进行了排名。在其余无法与成分标签匹配的添加剂中，大多数（430种添加剂）是调味剂，通常以人工或天然调味剂的名义出现在标签上。由于缺乏有关调味成分的公开信息，我们无法评估其使用频率或估计饮食摄入量。少于10个产品标签中存在的18种添加剂未包括在进一步评估中（苯甲酸苄酯，甜菜碱，丁二醇，对羟基苯甲酸丁酯，丁酸，柠檬醛，磺基琥珀酸二辛酯钠，薄荷醇，肉豆蔻酸，油酸，苯氧乙醇，胡椒碱，白藜芦醇，碘化钠，单宁酸，松油醇，可可碱，木糖）。存在于10多种产品的标签上的63种物质按其功能类别分类（图1），并包含在后续分析中。　　与直接食品添加剂相比，通过暴露频率确定间接食品添加剂的优先级具有挑战性，因为这些物质未在成分标签上披露。美国FDA有效食品接触物质通知清单列出了截至2020年9月已在美国获准用作食品接触物质的1493种化合物(其中71种被替换)[36]。根据过去十年的美国FDA食品接触物质库存数据，平均每年大约有65种新的食品接触材料获得美国FDA批准。对于间接的案例研究食品添加剂，我们专注于全氟和多氟烷基物质(PFAS)系列，这些物质已在食品接触材料中使用了数十年[37,38]，并且与免疫系统毒性相关[35]。基于PFAS的材料已用于食品加工设备中的密封垫，重复使用的塑料，炊具上的不粘涂层以及纸和纸板食品包装上的耐油和耐水涂层[35]。这些PFAS材料(通常为聚合物)可以包含并释放单体PFAS以及PFAS碎裂产物[39]。根据美国国家健康与营养调查的数据进行的一项最新研究报告，人体中PFAS的浓度与包装中可能含有PFAS的餐食的摄入量之间存在关联，例如快餐，比萨饼和爆米花[40]。食品接触材料中使用的PFAS结构的一些示例如图2所示。图2.几种PFAS食品接触材料的结构。 （A）显示了聚四氟乙烯或PTFE的结构，用于炊具，平底锅和器皿上的涂层。 （B）显示了自2008年以来美国FDA批准的多种食品接触物质中存在的6：2氟调聚物结构，这些物质将于2020年7月开始自愿淘汰[41]。 （C）显示了氟化单体成分，该成分与全氟乙烯和乙烯一起用于制造2018年批准的PFAS基三元共聚物（美国FDA食品接触通知批准号1914）。 （D）显示了2010年批准的全氟醚聚合物的氟化部分（美国FDA食品接触通知批准号962）。为了从食品接触材料中识别出报告为最终在食品中的PFAS物种，我们根据PubMed的出版物（发现总结在附录A表A1中）汇总了PFAS迁移研究的信息。在所有确定的研究中，PFAS的迁移取决于食物的类型及其成分而变化，脂肪材料通常可以使PFAS从食物包装到食物材料或食物模拟物的迁移最大，与长链的PFAS相比，短链PFAS的迁移更容易PFAS链，这一发现与文献中的其他报告相一致[42]。此外，鉴于实验室方法通常仅限于检测有分析标准的PFAS，因此很可能漏掉了可能会迁移到食品中的部分PFAS（按重量或化合物类型而定）。由于不确定这些化合物对公众健康的风险，美国FDA于2020年宣布自愿淘汰基于6：2含氟调聚物的食品接触物质（图2B）[41]。于2020年宣布自愿淘汰基于6：2含氟调聚物的食品接触物质（图2B）[41]。3.2. ToxCast活性分析的鉴定在迁移研究中鉴定出的22种独特PFAS（附录A表A1）中，有9种具有特定化合物或其盐的ToxCast数据（表1）。选择了这些PFAS和63种直接添加剂进行进一步审查（表2）。 ToxCast的检测覆盖范围从全氟辛烷磺酸锂的238种检测和丁基化羟基茴香醚的250种检测到PFOA和PFOS的1000多种检测不等。对于我们的初始分析，我们包括了在美国EPA CompTox仪表板中分类为“活性”的ToxCast分析，其模拟的AC50值（半最大活性）低于单个物质计算出的细胞毒性极限。表1.半数最大活性浓度（AC50）低于细胞毒性极限的全氟和多氟烷基物质（PFAS）的ToxCast分析次数。注意：基于2020年9月公开发布的ToxCast数据。该表包括无任何数据质量标记的测定和带有单个数据质量标记（“功效低于50％”）的测定。 表2.直接最大活性浓度（AC50）低于图1中确定的细胞毒性极限值的一半的直接食品添加剂的ToxCast分析次数。在表1列出的PFAS中，全氟十一烷酸（PFUnDA），全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛酸（PFOA）的活性ToxCast分析次数最多。在直接食品添加剂中，三种与结构相关的防腐剂，叔丁基对苯二酚（TBHQ），没食子酸丙酯和对羟基苯甲酸丙酯，以及食品着色剂FD＆CRed 3（也称为赤藓红），具有最多的活性分析，且数据质量和AC50均良好。低于其细胞毒性极限，表明它们在高通量分析中具有广泛的生物学活性（表2）。审查了活性测定次数最多的物质对免疫系统的潜在影响。3.3. 在比较毒物基因组学数据库中识别免疫特异性相互作用为了询问以前的研究是否报告了这些食品添加剂的免疫相关作用，我们通过在“免疫系统过程”和物质下搜索“比较毒物基因组学数据库”[29]，审查了表1和表2中鉴定出的每种物质的化学表型相互作用。名称。我们还对PubMed进行了“物质名称和T细胞或B细胞或天然杀手或免疫或免疫毒性”的搜索查询。人工审查了比较毒物基因组学数据库中列出的免疫系统相互作用的参考文献，并对照PubMed鉴定的研究进行了交叉核对，以确认比较毒物基因组学数据库中列出的研究检查了某种物质对免疫相关物质的直接影响。参数和功能。维生素在《比较毒物基因组学》数据库中表现出与“免疫系统过程”有关的多种表型相互作用，在PubMed中也有许多相关出版物。由于维生素对于免疫系统和其他生物过程必不可少，因此可以预料到这一结果。在其余直接添加剂组中，三种物质在比较毒物基因组数据库中具有“免疫系统过程”相互作用：月桂基硫酸钠（两种相互作用），TBHQ（12种相互作用）和二氧化硅（89种免疫介导的相互作用）吸入二氧化硅和相关物质后会产生炎症反应。在PFAS中，PFOA具有“免疫系统过程”的35个已记录交互，而PFOS具有3个。比较毒物基因组学数据库中的数量有限或缺乏相互作用并不表示该物质不会影响特定的活动，因为可能尚未进行测试来评估该终点，或者是因为进行了相关研究（例如由政府机构进行的测试）或化学品制造商，可能未包含在数据库中。例如，Rice等。报道了PFHxA和6：2 FTOH对免疫系统的不利影响[43]。但是，这些化合物在《比较毒物基因组学数据库》中没有任何免疫相互作用。另一方面，先前的研究报道TBHQ会改变多个免疫参数[44-46]，而PFOA会抑制免疫系统并降低对疫苗的抗体反应[47]，比较毒物基因组数据库记录了这两种物质的免疫相关相互作用。3.4. 弓形虫免疫相关检测分析我们回顾了本研究中所有化合物的有效ToxCast分析，并观察到食用色素FD＆C Red 3，抗氧化剂防腐剂TBHQ和全氟十一烷酸均显示出对多种免疫相关基因靶标的活性（表3）。目标包括免疫系统内与细胞通讯有关的分泌蛋白（趋化因子，细胞因子和生长因子）。免疫细胞表面受体（跨膜蛋白CD38，CD40，CD69以及白三烯和前列腺素受体）；以及介导白细胞与其他细胞类型（E选择素，P选择素，ICAM1和VCAM1）之间相互作用的细胞粘附分子。这些蛋白质介导了免疫细胞的串扰以及对病原体的先天和适应性反应的编排。在表3列出的测定中，除一种测定外，所有测定均来自Toxcast中的BioSeek测定平台。这种高通量的筛选平台基于人类原代细胞，各个BioSeek分析可能包括内皮细胞，外周血单核细胞，支气管上皮细胞或成纤维细胞[48]。 BioSeek分析使用抗体来检测目标蛋白表达的增加（增加）或减少（减少）[48]。受到TBHQ，FD＆C Red 3和PFUnDA影响的BioSeek分析方法的方向为“向下”，表明目标蛋白的细胞表面表达下降。由于BioSeek分析平台使用人类细胞，因此这些分析中的物质活性表明与人类免疫系统具有潜在的相关性。全氟癸酸（PFDA）在某些与PFUnDA相同的免疫目标测定中具有活性（表3）。令人惊讶的是，PFOA，PFOS和全氟壬酸（PFNA）没有显示出强活性。 PFNA影响了一种针对细胞因子CXCL10的检测方法。 PFOS影响了两个靶标，即CXCL10和HLA-DRα，这是主要的组织相容性复合物II类抗原呈递分子。 PFOA是一种经过充分研究的PFAS，具有对免疫系统的抑制作用，但在一项与免疫相关的测定中活性较弱，该测定针对的是白三烯B4受体（一种参与免疫反应和炎症的跨膜受体）。先前的研究报道了ToxCast测定中针对雌激素受体和过氧化物酶体增殖物激活受体的PFOA活性[26,49]，表明ToxCast可以鉴定该物质的有效测定。对于表1中列出的其他PFAS（全氟庚酸，全氟己酸，6：2含氟端粒醇和8：2含氟端粒醇）。最后，我们在针对与细胞外基质重塑，凝血和纤维蛋白溶解有关的蛋白质的子集测定中鉴定了TBHQ，FD＆C Red 3，PFDA和PFUnDA的活性，这些蛋白质涉及先天性和适应性免疫应答，炎症和宿主防御（表4）。对于这组目标，FD＆C Red 3在大多数测定中均显示活性，其次是PFUnDA，TBHQ和PFDA。 PFOS影响一种靶标基质金属蛋白酶9的表达。在我们的研究中，没有其他PFAS影响表4中列出的ToxCast靶标。在免疫特异性ToxCast分析中观察到的TBHQ和PFUnDA活性与研究文献一致。据报道，TBHQ会影响不同的免疫系统参数和功能[44-46]。流行病学研究已经报道了PFUnDA的免疫抑制作用[50,51]，与其他PFAS的数据一致。相反，在具有免疫特异性靶标的测定中，FD＆CRed 3的活性是出乎意料的。在《比较毒物基因组学数据库》中没有发现这种合成食品着色剂的免疫系统过程相互作用。同样，我们无法在PubMed中鉴定出报告FD＆C Red 3的免疫系统作用的研究。鉴于该化合物在ToxCast中免疫靶向测定的子集中具有活性，因此在标准版的FD＆C Red3中测试FD＆C Red 3很重要。免疫毒性测定。TBHQ在ToxCast分析中也很活跃，可测量转录因子Nrf2（核因子，类红细胞2样2），芳基烃受体和糖皮质激素受体的活性（表5）。先前的研究报道，TBHQ的作用是通过Nrf2介导的，Nrf2是一种转录因子，可调节涉及抗氧化反应，损伤和炎症的基因[52,53]，还可以通过芳基烃受体（AhR）[54,55]介导。芳基碳氢化合物受体介导细胞对多种异源物质的反应，目前已知在免疫系统中起着重要的调节作用[56]。在ToxCast分析中与TBHQ相关的Nrf2和AhR激活支持了TBHQ活性的特异性。在ToxCast分析中，PFOA，PFOS和6：2 FTOH也激活了Nrf2（表5）。点击查看：下部分内容更多有关生物学文章更多医学分类文章使用文档翻译功能 免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网站无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。来源于：mdpi