人类冠状病毒：病毒与宿主相互作用的综述

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南洋理工大学生物科学学院，南洋大道60号，新加坡637551；新加坡； YVON0016@e.ntu.edu.sg（Y.X.L.）; S150004@e.ntu.edu.sg（Y.L.N.）; JPTAM@ntu.edu.sg（J.P.T.）

收到：2016年6月8日;接受：2016年7月18日；发布时间：2016年7月25日

摘要：人类冠状病毒（HCoV）是已知的与一系列呼吸结果相关的呼吸道病原体。在过去的14年中，重度急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的发作使HCoV在人类中具有很高的致病性，已成为研究界的关注焦点。HCoV-宿主相互作用的研究为我们对HCoV发病机理的理解做出了广泛贡献。在这篇综述中，我们讨论了宿主细胞因子的最新发现，这些因子可能被HCoV利用以促进其自身的复制周期。我们还讨论了各种细胞过程，例如细胞凋亡，先天免疫，内质网应激反应，有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径和可能由HCoV调节的核因子κB（NF-κB）途径。

关键词：人冠状病毒；病毒与宿主的相互作用；细胞凋亡先天免疫；内质网应激MAPK；核因子κB

1. 介绍

人冠状病毒（HCoV）代表与严重性不同的多种呼吸系统疾病相关的主要冠状病毒（CoV），包括普通感冒，肺炎和支气管炎[1]。如今，由于HCoV具有高的基因组核苷酸取代率和重组能力，因此被公认为发展最快的病毒之一[2]。近年来，HCoV的进化也受到诸如城市化和家禽养殖等因素的推动。这些已允许物种的频繁混合，并促进了这些病毒的物种屏障和基因组重组的穿越[3]。迄今为止，已鉴定出六种已知的HCoV，即HCoV-229E，HCoV-NL63，HCoV-OC43，HCoV-HKU1，严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）；其中，四种HCoV（HCoV-229E，HCoV-NL63，HCoV-OC43和HCoV-HKU1）在全球范围内流通，约占人类普通感冒感染的三分之一[4]。在严重的情况下，这四种HCoV可以引起危及生命的肺炎和细支气管炎，特别是在老年人，儿童和免疫功能低下的患者中[1,5,6]。除呼吸系统疾病外，它们还可能引起肠道和神经系统疾病[7-11]。

SARS-CoV最初于2002-2003年在中国广东出现，是一种典型的非典型肺炎，其特征是发烧，头痛以及随后出现的咳嗽和肺炎等呼吸道症状，后来可能发展为危及生命的呼吸衰竭和急性呼吸窘迫综合征[ 12]。它在人类中具有很高的传播性，并迅速传播到29个国家/地区，感染了8000多人，死亡率约为10％[13,14]。最初，棕榈果被认为是病毒的天然贮藏库[15]。但是，随后的系统发育研究指出，SARS-CoV的蝙蝠起源是基于蝙蝠中发现的SARS样病毒序列[16]。 2012年，沙特阿拉伯出现了MERS-CoV流行病，其临床症状与SARS-CoV类似，但是死亡率要高得多，约为35％[17]。与表现出超级传播事件的SARS-CoV不同，MERS-CoV的传播受地域限制[12]。实际上，报告的MERS-CoV病例通常源于中东国家内的暴发或近期到该地区的旅行[18,19]。

分类学，基因组结构和形态

CoV是冠状病毒科下的一组大型包膜RNA病毒。冠状病毒科与Artierivirdae和Roniviridae一起归类于Nidovirale顺序[20]。根据国际病毒分类学委员会的建议，基于整个病毒基因组的序列比较，冠状病毒进一步分为四个主要属，α-，β-，γ-和三角冠状病毒[21,22]。这些冠状病毒可感染多种宿主，包括禽，猪和人类。已鉴定出HCoV属于Alpha或Beta冠状病毒属，包括Alphacoronaviruses，HCoV-229E和HCoV-NL63以及Betacoronaviruses，HCoV-HKU1，SARS-CoV，MERS-CoV和HCoV-OC43（表1）。

在电子显微镜下，冠状病毒病毒颗粒看起来大致呈球形或中等多形性，由刺突蛋白（S）形成独特的“棍状”突起[23,24]。在病毒体内部有一个螺旋对称的核衣壳，它包裹着一个巨大的单链和正向RNA病毒基因组，其大小约为26至32千个碱基[20]。正性病毒基因组RNA充当信使RNA（mRNA），包括51个末端帽结构和31个poly A尾巴。这种基因组RNA在病毒生命周期中具有三种功能：（1）作为感染周期的初始RNA； （2）作为复制和转录的模板； （3）作为包装入子代病毒的底物。复制酶-转录酶是唯一从基因组翻译的蛋白质，而所有下游开放阅读框的病毒产物均来自亚基因组mRNA。在所有冠状病毒中，复制酶基因约占基因组的51分之三，由两个重叠的开放阅读框（ORF），ORF1a和ORF1b组成，它们编码16个非结构蛋白。 CoV基因组RNA的最后三分之一编码四个结构蛋白基因的CoV规范集，顺序为尖峰（S），包膜（E），膜（M）和核衣壳（N）。此外，还沿着结构蛋白基因散布了一些辅助ORF。

CoV物种的数量和位置各不相同[25]（图1）。

图1.人类冠状病毒（HCoV）的基因组组织。 

HCoV基因组的大小范围约为26至32千个碱基（kb），如刻度上方的黑线所示。冠状病毒（CoV）基因组通常按51-ORF1a-ORF1b-S-E-M-N-31的顺序排列。重叠的开放阅读框（ORF）ORF1a和ORF1b占冠状病毒基因组的三分之二，该基因组编码了病毒RNA合成所需的所有病毒成分。基因组31末端的另外三分之一编码一组结构蛋白（橙色）和非结构蛋白（绿色）。

表1.人冠状病毒的分类。

2. 宿主因素参与病毒复制和发病机理

作为细胞内专性寄生虫，HCoV利用宿主细胞机制进行自身复制和传播。由于病毒与宿主之间的相互作用是疾病的基础，因此有关其相互作用的知识引起了极大的研究兴趣。在这里，我们描述了细胞在冠状病毒感染周期中的作用的已知情况：附着；进入宿主细胞；复制酶-转录酶的翻译；基因组复制和mRNA转录；新包装的病毒体的组装和萌芽（图2）。

图2.冠状病毒复制周期。冠状病毒感染始于刺突蛋白（S）的S1结构域与其同源受体的附着。这驱动了S中S2亚基的构象变化，促进了病毒和细胞质膜的融合。核衣壳释放到细胞质后，病毒gRNA通过核糖体移码翻译产生多蛋白pp1a和pp1ab。 pp1a和pp1ab由宿主和病毒蛋白酶进行蛋白水解处理，生成16个非结构蛋白（NSP），然后将其组装形成复制酶-聚合酶。复制酶-聚合酶参与冠状病毒的复制，在该过程中基因组RNA被复制，亚基因组RNA被转录并翻译以形成结构蛋白。产生的病毒产物将在ERGIC中组装，并以光滑壁囊泡的形式发芽到质膜，通过胞吐作用排出。促进感染和抑制感染的宿主因子分别以绿色和红色突出显示。 APN，氨肽酶N； ACE2，血管紧张素转化酶2； DPP4，二肽基肽酶4； 9-O-Ac唾液酸，9-O-乙酰化唾液酸; IFITM，干扰素诱导的跨膜蛋白； ATP1A1，ATPase，Na + / K +转运，α1多肽; HnRNP A1，异核核糖核蛋白A1； MADP1，锌指CCHC型和RNA结合基序1； DDX1，ATP依赖性RNA解旋酶； PCBP1 / 2，Poly r（C）结合蛋白1/2;PABP，Poly A结合蛋白；COPB2，Coatomer蛋白复合物，β2亚基（β素）； GAPDH，甘油醛3-磷酸脱氢酶； ERGIC，内质网高尔基体中间隔间；ER，内质网；VCP，含缬氨酸的蛋白。

2.1. 冠状病毒附着和进入

CoV感染是通过刺突（S）蛋白附着于特定宿主细胞受体而引发的。宿主受体是病毒的致病性，组织嗜性和宿主范围的主要决定因素。 S蛋白包含两个结构域：S1和S2。 S1结构域及其同源受体之间的相互作用触发S蛋白的构象变化，然后通过S2结构域促进病毒和细胞膜之间的膜融合。今天，所有HCoV使用的主要宿主细胞受体是已知的：HCoV-229E产生的氨肽酶N[26]，SARS-CoV产生的血管紧张素转换酶2（ACE2）[27]和HCoV-NL63[28,29]，二肽MERS-CoV的肽酶4（DPP4）[30]和HCoV-OC43和HCoV-HKU1的9-O-乙酰化唾液酸[31,32]。

除了常规的内体进入途径外，某些冠状病毒也可能进入通过非内体途径，或两者结合的细胞。细胞环境中的低pH值和内体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶可能有助于促进膜融合和内体CoV细胞进入[33]。最近的证据支持组织蛋白酶L在SARS-CoV和MERS-CoV进入中的作用[34-36]。其他宿主蛋白酶，例如跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）和气道胰蛋白酶样蛋白酶TMPRSS11D，也可以在HCoV-229E和SARS期间进行S1 /S2裂解以激活S蛋白，使非蛋白体病毒进入细胞质膜。 -CoV感染[37,38]。此外，MERS-CoV也被弗林蛋白酶激活，弗林蛋白酶是一种丝氨酸内肽酶，已与其他RNA病毒的细胞进入和病毒流出过程中的S1/ S2裂解有关[39]。

许多宿主细胞还利用其自身的因素来限制病毒的进入。利用细胞培养系统和假型病毒，许多研究小组确定了干扰素诱导型跨膜蛋白（IFITM）家族，它们可以抑制全局循环的HCoV-229E和HCoV-NL63 S蛋白介导的进入，以及高致病性的SARS-CoV和MERS -CoV [12,40]。尽管IFITM的作用方式仍然难以捉摸，但一些研究小组进行的细胞间融合试验表明，IFITM3通过调节宿主膜的流动性来防止病毒包膜与质膜或内体膜融合，从而阻止了包膜病毒的进入[ 41]。

2.2. 冠状病毒复制

在病毒核衣壳释放并脱去细胞质后，CoV复制开始于将ORF 1a和1b翻译成多蛋白pp1a（4382个氨基酸）和pp1ab（7073个氨基酸）。在这里，下游的ORF1b通过核糖体移码机制进行翻译，在这种机制中，翻译的核糖体沿´1方向从ORF1a阅读框转移到ORF1b阅读框。通过两个RNA元件（51-UUUAAAC-31七核苷酸滑序列和RNA假结结构）可以实现重新定位。随后，将多蛋白pp1a和pp1ab切割成至少15 nsp，它们组装并形成复制转录复合体。通过复制酶聚合酶的组装，转录基因组RNA的全长正链，形成全长负链模板，用于合成新的基因组RNA和重叠的亚基因组负链模板。然后将这些亚基因组mRNA转录并翻译以产生结构蛋白和辅助蛋白。已经发现几个异源核糖核蛋白（hnRNA）家族成员（hnRNPA1，PTB，SYN-CRYP）对于有效的RNA复制是必不可少的[42]。还建议其他RNA结合蛋白在冠状病毒复制中发挥作用，例如间-α固醇酶和聚A结合蛋白（PABP），DDX1，PCBP1 / 2和锌指CCHC型和RNA结合基序1 （MADP1）[43-45]。

2.3. 冠状病毒组装和出口

随着新基因组RNA和结构组分的积累，病毒体的组装很快得以实现。在感染周期的这个阶段，含有基因组RNA的螺旋核衣壳与其他病毒结构蛋白（S，E和M蛋白）相互作用形成组装的病毒体。 CoV颗粒的组装是通过从内质网到高尔基体的分泌途径中早期的膜状螺旋核衣壳出芽而完成的。

中间隔层（ERGIC）。很少探讨宿主在感染周期此阶段的贡献。目前，已知M蛋白通过在组装位点选择和组织病毒包膜成分并介导与核衣壳的相互作用来使病毒粒子出芽来协调整个组装过程[46]。M蛋白与不同的病毒结构蛋白（例如E蛋白）相互作用，组装成成熟病毒。这种相互作用产生了病毒粒子包膜的支架，并诱导了M蛋白修饰的膜以及与S蛋白的萌芽和释放，从而将刺突组装到病毒包膜中[46,47]。组装和出芽后，病毒粒子在囊泡中运输，并最终通过胞吐作用释放。在最近的一项研究中，抑制含缬氨酸的蛋白质（VCP / p97）导致病毒在感染性支气管炎病毒（IBV）的早期内体中蓄积，表明VCP在负载病毒的内体成熟中发挥了作用[48]。

3. 人冠状病毒感染和凋亡

凋亡是程序性细胞死亡的过程，其受到严格调节和消炎。当细胞发生凋亡时，它们表现出特定的标志，例如细胞萎缩，广泛的质膜起泡，核变性，DNA断裂和质膜的不对称分布[49-51]。迄今为止，已经建立了两种主要的细胞凋亡机制-外在途径和内在途径。外在途径是通过细胞外死亡配体（例如Fas配体（FasL）和TNF受体相关的凋亡诱导配体（TRAIL））与来自肿瘤坏死因子（TNF）超家族的死亡受体的结合而启动的[52] ]。然后，这些死亡受体募集各种死亡衔接蛋白，例如Fas相关的死亡结构域蛋白（FADD）[53]，以及启动子蛋白酶8和10形成诱导死亡的信号复合物（DISC）[54,55]。因此，两个启动子原蛋白酶被切割成其活性形式并诱导信号传导级联，最终激活效应子胱天蛋白酶3和7。另一方面，内在途径在细胞内部发生，并涉及线粒体外膜通透性（MOMP）的变化。 ）基于促凋亡和抗凋亡B细胞淋巴瘤2（Bcl2）家族蛋白质的比率（图3）。增强的MOMP会导致促凋亡因子（例如细胞色素c）的释放，从而激活启动子胱天蛋白酶9。像外在途径一样，内在途径中的启动子胱天蛋白酶9的激活会导致蛋白水解裂解效应子胱天蛋白酶3和7，进而分解许多蛋白酶。凋亡必不可少的关键细胞蛋白[56]。当Bid（一种促凋亡的Bcl2家族蛋白）直接被caspase 8裂解时，甚至在效应子caspase激活之前，两条途径之间的融合也可能发生。

在病毒感染期间，凋亡被诱导为宿主抗病毒反应之一，以限制病毒复制和生产。许多病毒已经进化出不同的策略来破坏细胞凋亡[58]。例如，某些病毒编码充当Bcl2家族蛋白同源物的病毒蛋白[59]。另外，病毒可能会通过其他分子途径，例如有丝分裂原活化蛋白（MAPK）和核因子κB（NF-κB）途径，直接或间接地建立调节Bcl2家族蛋白或半胱天冬酶激活的机制[60-65]。有趣的是，某些病毒可能会参与凋亡机制以进行有效的病毒感染。例如，甲病毒和黄病毒含有富含磷脂酰丝氨酸的病毒膜，以模仿凋亡细胞以促进病毒进入[66]。

3.1. 细胞趋向与凋亡

由于HCoV是已知可感染源自呼吸道的组织培养物和细胞系的呼吸道病原体，因此这些病毒也可能感染其他组织培养物和细胞系。这些组织和细胞的感染可能会诱导细胞凋亡[67,68]。然而，尽管HCoV在感染期间主要靶向呼吸道，但它们还与多种细胞类型的凋亡诱导相关，包括肠道粘膜细胞，肾小管细胞和神经元细胞[69-74]。对SARS-CoV感染组织的尸检研究表明，在肺，脾和甲状腺中诱导了细胞凋亡[75]。还显示出HCoV会感染免疫系统并诱导免疫细胞（例如巨噬细胞，单核细胞，T淋巴细胞和树突状细胞）凋亡[69,76-79]。因为这些免疫细胞与先天性和获得性免疫的激活有关，有理由推测，大量消除这些细胞可能是抑制宿主先天性和适应性免疫反应的一种病毒策略。在最近的研究中，据报道HCoV-229E感染导致大量CPE和树突状细胞死亡[80]。由于树突状细胞遍布我们的整个身体，因此有可能将它们用作促进病毒传播和损害我们的免疫系统的媒介[80,81]。

图3. Bcl2蛋白家族对MOMP的调节。 （a）Bcl2蛋白质家族根据其功能和Bcl2同源性（BH）结构域的数量分为三大类。生存前的Bcl2样家族成员（Bcl2，B细胞超大淋巴瘤（Bcl-XL），骨髓细胞白血病（Mcl1））包含所有四个BH结构域，并且具有抗凋亡作用。第二类称为Bcl2相关X（BAX）样蛋白，包括BAX和Bcl2同源拮抗剂杀手（BAK），具有促凋亡作用，并且缺少BH4结构域。最后，第三类称为仅BH3蛋白（Bid，与Bcl2相关的死亡启动子（Bad）和p53上调的细胞凋亡调节剂（PUMA）），仅包含BH3结构域，并且具有促凋亡作用。 （b）提出了两种模型来解释Bcl2家族蛋白在MOMP中的作用-间接激活剂模型和直接激活剂-抑制剂模型[11]。在间接激活剂模型中，抗凋亡的Bcl2样蛋白抑制Bax-Bak孔复合物插入线粒体，从而促进MOMP和细胞色素c的释放。但是，当仅BH3的蛋白被激活超过某个阈值时，Bcl2样蛋白的抑制作用就会被破坏。在直接激活物-抑制剂模型中，仅BH3蛋白充当直接激活物，以诱导Bak-Bak插入线粒体外膜。这些仅BH3的蛋白质可以被类Bcl2的蛋白质抑制，而后者又可以被另一类仅BH3的蛋白质抑制。该图是对[12]的修改。

3.2. 细胞凋亡的分子机制

在分子水平上，据报道，HCoV感染可通过多种机制触发细胞凋亡。SARS-CoV诱导的凋亡显示为caspase依赖性的，并可能被caspase抑制剂Z-VAD-FMK或Bcl2的过表达抑制[82,83]。尽管病毒复制是诱导细胞凋亡所必需的[83]，但细胞凋亡并不影响SARS-CoV的病毒复制动力学[82]。另一方面，MERS-CoV感染原代T淋巴细胞可诱导DNA片段化并激活caspase8和9激活，表明外部和内部途径均被激活。与SARS-CoV感染不同，MERS-CoV复制对于诱导受感染的T淋巴细胞凋亡不是必需的[79]。病原性较低的细胞也可以诱导细胞凋亡芯片数据证实，HCoVs菌株在HCoV-229E感染期间Bcl2家族成员的促凋亡和抗凋亡基因表达发生了显着变化[84]。 HCoV-OC43的感染可促进人神经元细胞中BAX易位至线粒体[74]。尽管胱天蛋白酶3和9在感染HCoV-OC43的鼠和人神经元细胞中被激活[9,74]，但添加泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK和半胱天冬酶9抑制剂Z-LEHD-FMK不会影响这些感染的神经元细胞的活力，表明由HCoV-OC43诱导的程序性细胞死亡可能与胱天蛋白酶无关[74]。这突出了在HCoV感染中诱导非经典程序性细胞死亡机制的可能性。

尽管在SARS-CoV中仅对此进行了研究，但HCoV感染过程中的凋亡机制很可能受病毒蛋白操纵（图4）。特别是，SARS-CoV S，N，E，M，ORF-6、7a和9b蛋白已显示在其宿主细胞中具有促凋亡功能[77,85-91]。 SARS-CoV E蛋白和7a蛋白的表达通过将抗凋亡的Bcl-XL蛋白螯合到内质网（ER）膜而促进了线粒体介导的细胞凋亡[77,92]。 SARS-CoV M蛋白也高度促凋亡，并介导半胱天冬酶8和9的激活[90]。此外，已显示HCoV-OC43野生型S蛋白在人神经元NT2-N和LA-N-5细胞系中诱导未折叠的蛋白应答（UPR），这可能导致细胞凋亡[93]。重组HCoV-OC43在其S蛋白处具有点突变，比野生型病毒诱导的caspase 3活化和核碎裂作用更强[93]。有趣的是，SARS-CoV N和9b蛋白的定位与caspase依赖性细胞凋亡的诱导有关[89,94]。这一发现为病毒蛋白的亚细胞定位和胱天蛋白酶激活之间的联系开辟了新的视角，而胱天蛋白酶激活是由HCoV调节细胞凋亡的一种方式。

图4. HCoVs激活细胞凋亡。死亡配体与死亡受体的结合诱导胱天蛋白酶8激活，继而激活效应子胱天蛋白酶3和7以刺激细胞凋亡。另一方面，内在途径受促凋亡和抗凋亡的Bcl2家族蛋白（如Bcl-XL，Bcl2，Bax和Bak）调控，以诱导MOMP。随后由增强型MOMP引起的caspase 9激活刺激了caspase 3和7激活。在HCoV感染过程中，病毒或特定病毒蛋白（橙黄色方框）靶向外部和固有凋亡信号通路的多个阶段。

4. 人冠状病毒感染和先天免疫

当细胞暴露于病原体（如病毒）时，免疫应答以宿主防御的形式被诱导。在病原体暴露期间，以细胞类型依赖性方式调节免疫应答。在产生适应性免疫系统之前，先天免疫是抵御病毒的第一道防线。宿主和病毒都可以操纵先天免疫机制作为防御或逃避策略的一种形式[95,96]。

4.1. 模式识别受体

免疫系统中的细胞通过几种识别策略来检测病毒病原体。其中，特征最清楚的是模式识别受体（PRR），其通过称为病原体相关分子模式（PAMPs）的进化保守结构与各种微生物病原体结合。 PRR主要分为三类，即Toll样受体（TLR），视黄酸诱导型基因I（RIG-1）样受体（RLR）和核苷酸寡聚化域（NOD）样受体（NLR）。

TLR是一种I型跨膜蛋白，位于细胞表面或内体囊泡中。它们的富含亮氨酸的重复序列（LRR）域介导了对PAMP的识别以及来自细菌，真菌和病毒等各种来源的损伤相关分子模式（DAMP）[97]。 TLR的激活主要发生在抗原呈递细胞中，例如树突状细胞（DC），巨噬细胞，单核细胞和B细胞。在人类的10种已知TLR中，发现TLR2、3、4、7和9与病毒检测有关[98,99]。 TLR3识别双链RNA（dsRNA），这是病毒RNA复制过程中产生的复制中间体[100]。TLR7和8检测单链RNA（ssRNA），TLR9识别DNA病毒中存在的未甲基化CpG DNA [101-103]。除核酸外，其他TLR（例如TLR2和4）还可以检测到病毒蛋白，例如呼吸道合胞病毒（RSV），肝炎病毒，麻疹病毒和人类免疫缺陷病毒[104-107]。识别病毒成分后，TLR募集含有Toll /白介素1受体（TIR）的信号转接头分子，例如MyD88（髓样分化主要反应蛋白88）和含有TIR域的衔接子诱导干扰素-β（TRIF）[108–110]。然后，MyD88和TRIF刺激MAPK和NF-κB途径，以增强IFN和促炎性细胞因子的产生[111]。

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