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冠状病毒,呼吸道合胞病毒和A型流感病毒的广谱抑制剂

冠状病毒,呼吸道合胞病毒和A型流感病毒的广谱抑制剂

Thapsigargin是主要人类呼吸道病毒的广谱抑制剂:冠状病毒,呼吸道合胞病毒和A型流感病毒


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thapsigargin(TG)在无细胞毒性水平下短时间(30分钟)暴露于人细胞,迅速引起延长的(≥48h)抗病毒状态,从而阻止了RSV复制。.png

1. thapsigargin(TG)在无细胞毒性水平下短时间(30分钟)暴露于人细胞,迅速引起延长的(≥48h)抗病毒状态,从而阻止了RSV复制。 TG在(A)感染前24小时或(B)感染后24小时以剂量依赖性方式引发,可阻止RSV产生。 (A)用TG或对照DMSO灌注HEp2和A549 30分钟,用PBS洗涤并在RSV感染前在正常培养基中孵育24小时,或(B)首先在TG 30分钟之前用RSV感染24小时启动。 TG诱导的抗病毒状态持续至少48小时。如图所示,用TG或DMSO对照将HEp2(C)和A549(D)细胞灌注30分钟,用PBS洗涤,再进行24或48小时的正常培养;之后,细胞被RSV感染。所有细胞均以0.1 MOI感染RSV(A2株,ATCC VR-1540),共3天。收集离心的上清液感染HEp2细胞24小时,用小鼠抗RSV(2F7)抗体(pfu / mL)免疫检测RSV。2向ANOVA(Sidak的多次比较)的意义与相应的DMSO控件有关。与A549细胞相比,HEp2细胞更易于RSV复制。 TG抑制RSV转录。在RSV感染之前,立即用0.5µMTG灌注HEp2细胞(E)30分钟,在RSV感染之前(F)用TG灌注HEp2细胞30分钟,用PBS洗涤并培养48小时。总共感染3天后,提取总RNA进行cDNA转换,以量化标准化为18srRNA的病毒基因(L基因,M基因和F基因)表达。通过相对于相应DMSO对照中表达的未配对t检验确定显着性。 (G)用指定浓度的TG或DMSO对照预孵育30分钟的(Hp2和(H)A549细胞)用PBS洗涤,在无血清培养基(Opti-MEM)中培养过夜,并进行细胞活力测定(CellTiter-Glo®发光细胞活力测定试剂盒,Promega)。水平条=平均值(红色)±标准偏差;ns =不重要。与Dunnett进行多次比较的单向方差分析的意义是相对于相应的DMSO控件而言的。所有测定均一式三份,进行三次。 *p <0.05和**** p <0.0001。


 

TG作为抗病毒药比利巴韦林更有效,显示出高选择性指数并阻止病毒转录和病毒蛋白产生。.png

 

2. TG作为抗病毒药比利巴韦林更有效,显示出高选择性指数并阻止病毒转录和病毒蛋白产生。如前所述,在培养基中或在单独培养基中连续存在利巴韦林时,将HEp2细胞用TG,利巴韦林或DMSO对照引发30分钟,如前所述用PBS洗涤并用RSV感染(用于TG或DMSO对照)。以4 dpi收获培养基,用于(A)子代病毒滴定(pfu /mL)和(B)通过一步反转录-qPCR检测病毒L基因RNA。除非另有说明,否则单向ANOVA(Tukey的多次比较)的显着性是相对于DMSO控件而言的。在HEp2细胞的RSV感染中,TG的相应选择性指数(SI)估计为984(C,D)。在TG的感染前引发范围内,分别通过pfu / mL病毒滴定和发光细胞活力测定法确定HEp2细胞中TG对RSv的有效浓度(EC)和细胞毒性浓度(CC)。 SI = CC50 / EC50 = 63.43 / 0.06447 = 983.9。 EC90 = 84.55 nM。如图所示,用TG或DMSO对照引发NHBE细胞30分钟,用PBS洗涤并以0.1 MOI感染RSV。在48 hpi时,通过一步反转录qPCR(E)收集用于检测病毒L基因RNA的培养基,提取总RNA进行cDNA转化以定量病毒基因的表达(L基因,F -基因和M基因)标准化为18s rRNA(F)。单向ANOVA(Dunnett的多重比较)(E)和两向ANOVA(Tukey的多重比较)(F)的意义与DMSO控件有关。 TG还抑制NHBE细胞中病毒F蛋白的产生。如图所示,用TG或DMSO对照灌注细胞30分钟,用PBS洗涤,并在80℃下用RSV感染

0.05 MOI持续48小时,并直接免疫染色是否存在RSV F蛋白(G,H)。以100倍放大率拍摄的图像。随着TG启动剂量的增加,RSV阳性细胞(pfu)的数量明显减少。单向方差分析(Dunnett的多次比较)的意义与DMSO控件有关。 * p <0.05,*** p <0.001和**** p <0.0001。

NHBE细胞的TG引发增加了ER应激基因的表达(感染前和感染后)和RIG-I信号传导相关基因的基础表达,但是在感染过程中,RIG-I关联基因的诱导是衰减。.png

3. NHBE细胞的TG引发增加了ER应激基因的表达(感染前和感染后)和RIG-I信号传导相关基因的基础表达,但是在感染过程中,RIG-I关联基因的诱导是衰减。用TG或DMSO对照引发细胞30分钟,用PBS洗涤并在0.05 MOI下用RSV感染48小时,然后提取总RNA进行cDNA转化以定量ER应激基因的表达(A)DDIT3,(B)HSPA5 (C)HSP90B1。将表达标准化为18s rRNA,通过2向ANOVA(Sidak的多次比较)确定的显着性相对于相应的DMSO对照。有一致的迹象表明,TG启动引发了RIG-I相关基因RIG-I(D),IFNB(E)(以及相应的IFNB蛋白(F))和RNASEL(G)的感染前激活。在16hpi对上清液进行IFNB ELISA。将所有RNA表达标准化为18s rRNA,并通过单向ANOVA和Dunnett的多重比较(D)或2向ANOVATukey的多重比较(E–G)确定的显着性相对于相应的DMSO对照。所有测定均一式三份,进行三次。*p <0.05,** p <0.01,*** p <0.001和**** p<0.0001。

 TG抑制OC43病毒的转录和蛋白质的产生,作为抗病毒剂比羟氯喹和瑞姆昔韦更有效,并且显示出高选择性。 .png

 

4. TG抑制OC43病毒的转录和蛋白质的产生,作为抗病毒剂比羟氯喹和瑞姆昔韦更有效,并且显示出高选择性。 (A,B)用TG引发A549细胞30分钟,用PBS洗涤两次,并在0.5MOI下用OC43感染3小时。然后,将细胞再次用PBS洗涤,并在无血清培养基(补充有0.1 µg / mL TPCK胰蛋白酶的Optii-MEM)中培养48小时,然后从(A)培养基和(B)细胞中提取RNA,分别进行反转录qPCR和cDNA转换,再进行qPCR,以检测病毒OC43复制酶多蛋白1ab RNA。 cDNA定量标准化为18s rRNA。 (C)使用重复的孔组进行细胞蛋白提取,以通过蛋白质印迹法检测OC43 NP。 (D,E)如图所示,用TG,羟氯喹(HC)或DMSO / PBS对照对MRC5细胞进行预处理,持续30分钟,用PBS洗涤两次,用OC43(0.01 MOI)感染3 h,再用PBS两次,最后在无化合物(感染前)或持续存在HC(连续)的情况下用无血清培养基补充。在2 dpi时,收集培养基用于(D)通过一步反转录qPCR检测病毒多蛋白1abRNA和(E)通过感染A549细胞24小时并免疫染色是否存在病毒NP来直接检测子代病毒。以100倍放大率拍摄的图像。所指示的显着性(通过单向方差分析确定)和病毒RNA检测的降低百分比相对于相应的对照。 (F,G)TG在阻止OC43(F)和甲型流感病毒G方面优于伦德韦(RDV))复制。用指示的TG,0.3 µM RDV或DMSO对照对A549细胞进行初次免疫30分钟,用PBS洗涤两次,并用0.01 MOI的CoVOC43或1.0 MOI的苏联H1N1病毒感染2小时,然后再次用PBS,然后在无血清培养基中孵育TG引发的细胞,或在连续存在RDV的培养基中孵育。在24、48和72 hpi时,基于相对Ct方法,对收集的上清液进行病毒RNA提取,然后进行一步反转录qPCR,以检测OC43复制酶多蛋白1ab RNA或流感M基因RNA的相对拷贝数。 。所指示的显着性是相对于基于2通ANOVA Dunnett(F)或Tukey(G)多重比较测试的RDV处理过的细胞而言的。 (H)RDV和TG处理对细胞活力没有不利影响。将A549细胞用RDV连续处理,或用指定的TG或DMSO处理30分钟,洗涤,培养过夜,然后进行细胞活力测定(CellTiter-Glo 2.0细胞活力测定,Promega)。通过单因素方差分析相对于DMSO对照确定指示的显着性。 (I)TG对OC43的抑制作用的选择性指数(CC50 / EC50)估计在7072和9227之间。EC90= 0.02622 µM。用TG(0至91 µM)灌注MRC5细胞30分钟,用PBS洗涤两次,并在含10%FCS和1%P / S的DMEM Glutamax中培养过夜。用CellTiter-Glo 2.0细胞活力测定(Promega)进行细胞活力测定(CC50)。有效或抑制TG的剂量反应(EC50)是基于以指定浓度的TG(0至0.5 µM)灌注MRC5细胞30分钟,然后进行PBS洗涤和以0.01 MOI的OC43感染。感染后三天,收集上清液用于RNA提取和一步反转qPCR以定量病毒RNA(多蛋白1ab RNA)的存在。 CC=细胞毒性; EC =有效浓度。 ** p <0.01,*** p<0.001和**** p <0.0001。


接下来,评估了在OC43病毒感染之前和期间对TG启动的ER应激反应。在A549细胞中,TG以剂量依赖性方式基础上和在感染过程中刺激ER应激基因的表达。 TG诱导的A549细胞OC43感染的ER应激基因图谱(图5A,C)与NHBE细胞的RSV感染的TG应激基因图谱高度相似(图3A,C)。在A549细胞中,TG启动似乎对RIG-I相关基因(RIG-I,IFNB和OAS1)的基础转录几乎没有影响。像在NHBE细胞的RSV感染中(图3D,G)一样,在TG引发的细胞的OC43感染过程中,RIG-I相关基因的诱导也减弱了(图5D,F)。因此,在OC43感染期间降低RIG-I相关基因的转录诱导也是TG介导的OC43病毒抑制的特征。重要的是,感染前TG引发的A549细胞与OC43病毒和苏联H1N1甲型流感病毒的共同感染(图5H)一样,能够抑制单独的病毒感染(图5G)。总之,A549细胞的TG引发在基础上和OC43感染期间增加了ER应激基因的表达,在感染期间减弱了RIG-1信号相关基因的诱导,并抑制了与OC43和流感病毒的共感染。

1.1. TG阻止子代SARS-CoV-2生产

SARS-CoV-2与OC43病毒一样易受TG抑制。用TG对Calu-3和NHBE细胞进行感染前预感染可阻断SARS-CoV-2复制(图6A,C),这与在A549和MRC5细胞中用OC43病毒所见的抑制作用相当(图4A,D)。在Calu-3细胞中,用SARS-CoV-2在TG感染24小时后用TG引发感染后30分钟也有效抑制病毒,表明其在SARS-CoV-2感染中具有治疗潜力(图6B)。与流感病毒抑制一样[14],TG无法抑制SARS-CoV-2在Vero E6细胞中的复制,这表明完整的I型IFN系统对于TG介导的宿主抗病毒应答是必需的(图6D)。

通过子代病毒RNA检测(图6E–H)和传染性子代确定,TG的广谱抗病毒效力在单独的病毒感染中与在SARS-CoV-2和pdm H1N1病毒共感染中一样明显在感染的Calu-3细胞的培养基中通过TCID50分析检测病毒(图6I–K)。在72 hpi下,

在单个病毒中,相对于相应的DMSO对照,0.5 µM TG引发的细胞相对于相应的DMSO对照,抑制SARS-CoV-2后代病毒产生300倍(99.7%)和880倍(99.9%)。

感染(图6I)和共同感染(图6J)。相对于相应的DMSO对照,在以0.5 µM TG引发的共感染细胞72 hpi时,pdmH1N1病毒的产量降低了11倍(93.3%)(图6K)。总体而言,在单病毒比较(图6E,F)和共感染(图6G,H)中,SARS-CoV-2与dd H1N1病毒感染相比,TG引发的后代病毒减少比例更高。这表明SARS-CoV -2比dm H1N1病毒对TG抑制更敏感。总之,TG是一种广谱抗病毒药物,主要针对人类主要呼吸道呼吸道合胞病毒,冠状病毒(特别是SARS-CoV-2)和甲型流感病毒,不能区分单病毒感染和复合病毒感染。

A549细胞的TG引发在基础上和在OC43感染期间增加了ER应激基因的表达,在感染期间减弱了RIG-I信号相关基因的诱导,并抑制了与OC43和流感病毒的共感染。.png

5. A549细胞的TG引发在基础上和在OC43感染期间增加了ER应激基因的表达,在感染期间减弱了RIG-I信号相关基因的诱导,并抑制了与OC43和流感病毒的共感染。 (A–C)。TG引发似乎以剂量依赖的方式刺激内质网应激基因的表达。 (D–F)TG在感染过程中减弱了RIG-I相关基因的诱导。 A549细胞用TG引发30分钟,用PBS洗涤两次,并在0.5 MOI下用OC43感染3小时;此后,再次用PBS洗涤细胞,并在无血清培养基中培养24小时,然后收集细胞裂解液用于RNA提取和cDNA转化,用于(A)DDIT3,(B)HSPA5,(C)HSP90B1,(D )RIG-1,(E)IFNB和(F)OAS1。将所有表达标准化为18s rRNA。意义相对于基于2向ANOVA(Tukey的多次比较)的相应DMSO控件。 (G,H)在单独的病毒感染或共同感染中,TG在A549细胞中抑制了OC43病毒和苏联H1N1病毒的复制。将细胞用TG灌注30分钟,用PBS洗涤两次,并在OC43病毒和OC43病毒和US H1N1病毒感染下

单病毒感染或共同感染3 h分别为0.01和1.5 MOI(基于FFA);之后,将细胞再次用PBS洗涤两次,并在无血清培养基中孵育。在48 hpi收获培养基用于病毒RNA提取,然后进行一步反转录qPCR,以检测OC43复制酶多蛋白1ab RNA和苏联H1N1 M基因RNA的相对拷贝数。所示的显着性基于2次方差分析Tukey的多次比较,并且病毒RNA检测的减少百分比相对于相应的DMSO对照。所有测定均一式三份,进行三次。 * p <0.05,** p <0.01,*** p <0.001和**** p <0.0001。


在单病毒感染和与pdm H1N1病毒共感染中,TG有效地阻止了子代SARS-CoV-2的产生。.png

 

6.在单病毒感染和与pdm H1N1病毒共感染中,TG有效地阻止了子代SARS-CoV-2的产生。 (A,C,D)Calu-3和NHBE细胞的感染前TG引发,但不是Vero E6细胞,有效地抑制了子代病毒的输出。按照指示用TG灌注细胞30分钟,用PBS洗涤两次,并在80℃下感染SARS-CoV-2。

0.01MOI 3小时;之后,将细胞再次用PBS洗涤两次,并在无血清培养基中孵育,该培养基中添加了0.2 µg /mL TPCK胰蛋白酶。在72 hpi的培养基上进行病毒RNA提取。 (B)在24 hpi用TG引发阻断了SARS-CoV-2在Calu-3细胞中的复制。首先以0.01 MOI的浓度将SARS-CoV-2细胞感染细胞24小时,

然后用指示的TG灌注30分钟,用PBS洗涤3次并在无血清培养基中孵育。在48和72 hpi的培养基上进行病毒RNA提取。根据相对Ct方法,对以上分离的所有RNA进行一步反转录qPCR,以检测SARS-CoV-2复制酶多蛋白1ab RNA的相对拷贝数。用TG对Calu-3细胞进行预感染引发可抑制(E)SARS-CoV-2和(F)pdm H1N1病毒的单独感染,以及(G,H)两种病毒的共同感染。用TG或DMSO灌注细胞30分钟,用

将相应的病毒以0.01 MOI的浓度持续2 h,用PBS洗涤3次,然后在无血清培养基中孵育。在感染后指定的时间点,对感染细胞的培养基进行采样以进行病毒RNA提取,以进行一步反转录qPCR,以检测SARS-CoV-2复制酶多蛋白1ab RNA(E,G)和流感的相对拷贝数M基因RNA(F,H)。 (IK)在相似感染的培养物上于24、48和72 hpi采集的培养基样本用于检测

通过在Vero细胞中进行TCID50病毒滴定来检测存活的子代病毒(显示为平均值±SEM)。 (一)在单病毒感染中

SARS-CoV-2,TG表现出剂量依赖性病毒抑制作用。在与SARS-CoV-2和pdm H1N1病毒共感染时,TG能够同时抑制SARS-CoV-2(J)和pdm H1N1病毒(K)。所示的显着性基于2向ANOVA Tukey的多次比较测试和相对于相应DMSO对照的病毒RNA变化百分比。 * p <0.05,** p<0.01和**** p <0.0001。


3.4. TG甲型流感病毒的翻译后阻断可在致命病毒攻击中保护小鼠

 

我们先前发现TG抑制NHBE细胞和NPTr细胞中流感病毒复制的过程中,病毒NP和M1蛋白的病毒转录或产量几乎没有或没有变化,表明该病毒在翻译后被阻断了[14]。由于病毒NP和M1蛋白在胞质核糖体上被翻译成核输入,因此我们在这里检查了通过ER-高尔基体运往宿主细胞膜的病毒蛋白(HA,NA和M2)[25]。来自TG引发的NPTr细胞的病毒蛋白分析(图7A,B)显示,所有其他病毒蛋白的表达似乎也未受影响,这表明TG差异性靶向了流感病毒,RSV和冠状病毒的复制周期。由于TG的抗病毒作用在酸性pH值而不是在碱性pH值下稳定(图7C,D),因此在小鼠致命流感病毒攻击中评估了TG的口服治疗(感染后)功效。组中的每只BALB / c小鼠(每组n = 8)首先经鼻内感染3种MLD50的PR8 / H1N1病毒,第二天每天一次通过管饲法给予TG或oseltamivir,持续5天。低口服剂量TG(根据经验选择1.5 µg / kg /天)所赋予的保护作用与高剂量奥司他韦(45 mg / kg /天)对小鼠的保护作用相似。在治疗上,与PBS-PBS相比,TG治疗组的存活率显着提高(图7E),感染后3天和5天(dpi)的病毒脱落减少(图7F),体重减轻程度较轻(图7G,H)。 DMSO控制。七只,八只和两只小鼠全部在TG,奥司他韦和PBS +DMSO组中存活。在所有三个参数中,用TG和奥司他韦治疗的小鼠之间没有显着差异。因此,口服TG在遭受致死性流感病毒攻击的小鼠中赋予治疗保护。

TG在翻译后抑制甲型流感病毒,对酸稳定,在致命病毒攻击中具有治疗性保护小鼠的作用。.png


7. TG在翻译后抑制甲型流感病毒,对酸稳定,在致命病毒攻击中具有治疗性保护小鼠的作用。 (A)由TG引发的NPTr细胞引起的流感后代产量急剧下降是(B),同时病毒蛋白没有下降。将细胞用TG灌注30分钟,用PBS洗涤两次,并以0.5 MOI的浓度感染USSR病毒2小时。之后,将细胞再次用PBS洗涤3次,并在无血清培养基中温育24小时,该培养基中添加了0.2 µgl /mL的TPCK胰蛋白酶。(A)用相应的培养基样品进行聚焦形成测定,以确定活病毒的产量(ffu / µL)。所示的显着性基于单向ANOVA(Dunnett的多重比较)和相对于相应DMSO对照的存活子代百分比。 (B)病毒蛋白,包括通过ER-高尔基体处理的蛋白(HA,NA和M2),未显示TG引发的细胞减少。(C,D)TG的抗病毒活性在酸性但不是碱性条件下是稳定的。(C)首先,将所用的TG首先按照指示在pH 1.5(在30mM盐酸中)孵育不同的时间,并用氢氧化钠中和,然后以0.5 µM的终浓度应用于细胞中30分钟。 (D)首先将所用的TG在pH12.0(10 mM氢氧化钠)中孵育2小时,并用盐酸中和,然后以0.5 µM的最终浓度将其应用于细胞30分钟。在以0.5 MOI的感染率感染苏联H1N1病毒后二十四小时,将感染的培养基用于6小时聚焦形成试验,以免疫检测病毒NP以确定子代病毒的产量(ffu/ µL)。除非另有说明,否则重要性基于单向ANOVA Tukey的多重比较,并且病毒减少的百分比与相应的DMSO控件有关。 (E–H)TG在小鼠致命流感病毒攻击中的治疗保护。组中的每只BALB / c小鼠(每组n= 8)都经鼻内感染了3种MLD50的PR8 / H1N1病毒。然后每天给每只小鼠口服一次TG(1.5 µg / kg /天),奥司他韦(45mg /kg /天)或PBS + DMSO,持续5天;第一次剂量为12 hpi。在14d内记录生存率(E),通过TCID50分析的肺病毒滴度(F)和体重变化(G,H)。每个时间点代表平均值±SEM。 Kaplan–Meier方法用于生存分析。相对于相应的TG组显示了显着性。 * p <0.05,** p <0.01,*** p <0.001和****p<0.0001。


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