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决定神经元运动回路的关键时期
在果蝇中发现了一种机制,该机制使称为星形胶质细胞的细胞向神经元发出信号,从而关闭了形成运动行为的发育窗口。劳拉·桑乔 (Laura Sancho)和 尼古拉·艾伦(Nicola J.Allen) PDF版本在生物体的发育中,有时形成的神经系统的某些部分对输入的变化特别敏感。破坏这些关键时期可能会对神经元连通性和大脑功能产生终生影响1。例如,在儿童时期有一个关键的时期要进行语言学习2。并且已建议改变关键时期在神经发育障碍中起作用,包括自闭症谱系障碍3和精神分裂症4。在视觉系统1中已经广泛描述了关键时期,但是直到现在,对非感官系统的关注也越来越少。Ackerman等人在《自然》中撰文。5缩小这个差距。作者确定了果蝇果蝇电机电路发育的关键时期,并确定了该系统中关键时期闭合的细胞和分子基础。在关键时期,神经元连接可以通过多种方式重塑。Ackerman等。主要解决稳态的可塑性,其中整个神经元发生变化-包括称为树突的结构的大小变化(从其他神经元接收突触连接的树突),突触数量和突触传递的电脉冲强度6。首先,作者使用了一种称为光遗传学的技术来激活或抑制两类称为aCC和RP2运动神经元的神经元的神经元活动。当他们使神经元沉默时,细胞树突的长度和体积都会增加。相比之下,光遗传学激活导致树突回缩。这些变化仅在幼虫孵化后的8小时内对神经元活动进行了控制,而仅需15分钟即可看到效果。接下来,Ackerman和同事询问树突形状的变化是否转化为aCC和RP2运动神经元的兴奋性和抑制性突触连接数的变化(这些突触分别激活和抑制神经元活动)。神经元的光遗传沉默导致抑制性突触数量的减少和兴奋性突触的增加。一起,树突的扩展和突触组成的变化使神经元重新平衡神经元的活动,抵消了光遗传学沉默的影响。aCC和RP2神经元的光遗传激活导致兴奋性突触数量减少,但抑制性突触却没有增加,这可能是由于树突回缩后可用于形成连接的细胞膜数量有限所致。一起,D.黑腹果蝇(图1a,b)。 图1 | 整形电机电路。阿克曼等。发现了一个关键期,在此期间果蝇果蝇(Drosophila melanogaster)形成了涉及运动神经元的运动回路,称为aCC和RP2 。在幼虫孵化后的8个小时内,可以修改称为树突的结构,该结构从其他神经元接收突触输入,但是这些树突在关键时期关闭后会稳定下来。b,在关键时期沉默神经元的活动会导致树突扩张。相反,神经元激活导致树突回缩。C,关键时期随着称为星形胶质细胞的邻近细胞的成熟而关闭。成熟的细胞产生蛋白质Nlg2,该蛋白质与神经元树突上的Nrx-1蛋白质相互作用。这种相互作用导致称为微管的结构稳定,从而阻止了进一步的树突重塑.是什么导致这些变化?神经元通常与称为星形胶质细胞的细胞紧密接触,这有助于调节突触的发育并维持脑功能7。Ackerman等。因此,利用基因工程技术消除了果蝇中的所有星形胶质细胞。幼虫孵化后八小时,树突状重塑持续进行,但是在八小时之前,重塑量没有增加。这些发现表明,星形胶质细胞调节aCC / RP2系统关键时期关闭的时间,但在此期间不具有可塑性。这是一个关键的区别,因为这表明这两种现象是不同的机制。   因此,阿克曼(Ackerman)及其同事试图确定关键时期结束所涉及的机制。他们使用了一种称为RNA干扰筛选的技术来抑制幼虫星形胶质细胞中不同的信使RNA分子翻译成蛋白质,然后分析了每个果蝇关键时期的关闭时间。这使他们能够确定可能调节关键时期关闭的基因。RNA干扰导致了几个基因的延长,从而延长了关键时期,但在许多情况下,它们的抑制作用也对星形胶质细胞的形状产生了深远的影响,因此很难将星形胶质细胞发育中的作用与关键性调控中的特定作用分离开来。时期。作者选择关注于基因nlg2,其抑制作用延长了关键时期而不改变星形胶质细胞的形状。小鼠的等效基因家族,神经胶蛋白,已经在大脑视觉皮层的关键时期与星形胶质细胞的成熟有关,而星形胶质细胞的成熟与这个关键时期的关闭紧密吻合8。在D. melanogaster中,Nlg2蛋白与蛋白neurexin-1(Nrx-1)相互作用,Ackerman及其同事发现该蛋白位于运动神经元树突中。作者表明,使用RNA干扰抑制aCC和RP2神经元中的nrx-1延长了关键时期-因此,Nrx-1可能是星形细胞Nlg2调节关键时期闭合的神经元受体(图1c)。符合这个想法,在星形胶质细胞或nrx-1中过表达nlg2 在aCC / RP2中,树突过早地关闭了关键时期,将其缩短为幼虫孵化后的四个小时。破坏关键时期可能会对神经回路功能和行为产生持久影响。实际上,Ackerman及其同事发现,延长关键时期(通过操纵nrx-1或nlg2)会导致运动行为异常,而幼虫在操纵后1.5天以异常螺旋状运动,这是分析的好时机因为在此阶段,幼虫正在主动进食并在培养基中移动。这些行为上的变化凸显了关键时期适当时机的重要性。Ackerman和同事的工作为以后的实验提出了疑问。例如,Nlg2和Nrx-1之间的相互作用如何调节临界期?当前的工作确定了相互作用在稳定称为微管的结构聚合物中的作用,以及在稳定树枝状晶体本身的结构中的作用。然而,导致微管稳定性的机制仍有待探索。此外,Nlg2和Nrx-1产生的动力学仍有待确定。这些蛋白质可以通过树突回缩或扩增来调节吗?树突回缩会因星形胶质细胞中nlg2表达的降低而导致吗?作者提供了令人信服的证据,证明星形胶质细胞在调节关键时期的闭合中起着重要作用。星形胶质细胞调节哺乳动物视觉系统9的关键时期可塑性,包括通过分泌的蛋白质chordin-like 1 10和hevin 11的作用。目前的研究表明,星形胶质细胞不仅可以调节感觉系统的关键时期,而且还可以调节运动系统的关键时期。确定关键时期闭合的机制尤为重要,因为闭合的改变会破坏正常的神经发育-因此,发现可能会导致深入了解与精神分裂症等神经发育障碍有关的机制3。此外,确定关键时期闭合的机制可以使研究人员了解大脑在成年后如何变得更少可塑性,为旨在增加脑损伤或疾病后神经可塑性的治疗方法提供了新途径。这项工作还表明,星形胶质细胞在调节关键时期的作用扩展到了无脊椎动物,从而突显了这些细胞在神经系统发育和成熟中的中心地位。越来越明显的是,星形胶质细胞和相关的细胞类型(统称为神经胶质细胞)是神经元可塑性的主要调节剂,尤其是在体内平衡和回路改变的情况下。展望未来,关键时期的研究必须考虑神经胶质的贡献。自然 592,360-361(2021) 点击:使用专业文献翻译功能使用文档翻译功能查看更多生物学文章免责声明:福昕翻译只充当翻译功能,此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的,仅代表作者个人观点,与本网站无关,版权归原始网站所有。仅供读者参考,并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等,请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。来源于:nature
2021-04-14 19:31:52
论文季文献翻译、查重,福昕翻译轻松帮你应对
时间飞逝,毕业季即将到来!对于毕业学子们来说,论文无疑是关心重点,因为这关乎着其是否能够顺利通过测试完成毕业!毕业季各种忙,不仅要进行论文写作,还需要完成初稿完成论文查重,期间不间断的修改与调整……而查看N多文献也是编写论文的重要部分,所以论文写作中最注重的是——效率。使用福昕翻译一键提高论文阅读速度。①福昕翻译:操作简单、一键翻译打开福昕翻译,选择【文档翻译】功能,将需要翻译的文档上传,点击【开始翻译】高保真文档译后下载内容对比:左侧是翻译前的原文,右侧是翻译后的译文,原来文档内容的排版格式依旧保持。翻译要求高的论文还有【专业版】文档翻译和人工翻译功能按需翻译。②翻译学堂:多种译文分类,免费看到爽10多种文章种类上百篇译文内容,涵盖医学、生物学、物理学、国外财经、文献热点等文章,译后文章免费阅览,更有各种翻译教程哪里不会看哪里。③福昕论文助手:快速查重、准确安全福昕论文助手是福昕旗下专业的自助论文检测平台,备受好评。支持检测多种语种和学科,提供免费论文检测,检测准确率高且指纹算法极致安全,分布式云计算,最快一分钟出结果。福昕翻译一款多功能翻译平台,简单的操作,27种语言免费互译,速翻让你方便阅读文献减少翻译的费时费力提高效率,打开福昕翻译体验更多翻译功能。
2021-04-08 18:37:12
为肌肉力局部耐力建议:重复连续性检查(总结)
安德森和Kearney的早期工作[5]支持沿着重复连续核对肌肉耐力的支持。这些研究人员分配了43名未经训练的年轻人,以便在高(3组6至8rm),中等 - (2套30至40rm)或低(100套100至150rm)负荷上进行替补卧室9周的研究期。在每个参与者的1RM的40%的40%评估相对耐久性,并且在所有参与者〜27公斤评估绝对耐久性。结果表明,低负载基团的绝对肌肉耐力增加了41%和39%(〜15重复的增加),而高负荷集团实现了28%的增益(增加〜9 rep- etitions)。与高负荷组中的降低7%相比,相对肌肉耐久性的增加分别为22%和28%,而低负载基团相比。通过石头和Coulter的后续研究[6]在使用高度 - (3套6至8 rm),中等 -(2组15至20rm)或低(1套30至40rm)负载。使用绝对和相对评估,对上半身(台压和下蹲)进行肌肉耐力测试。对于绝对的评估,上身的增益肌肉耐久性有利于中负荷条件,与高负荷条件相比(分别为44%,分别为31%和20%),与重复连续统一体不一致。或者,下半身肌肉耐久性评估表现出符合拟议重复连续体的结果,观察到的增加84%,80%和137%,分别用于高载荷和低负荷。基于预测试RM的肌肉耐久性的相对评估结果与绝对评估中观察到的相似性。上半身的结果显示U形反应,分别增加了58%,67%和54%,分别为高,中等和低负荷。另一方面,下半身肌肉耐久性有利于培训,低(83%)与高(66%)和中等 - (61%)负荷相比。这些发现表明,局部肌肉耐力的重复连续效果似乎与下半身比上身肌肉组织更相关。请注意,安德森和Kearney [5]和石头和Coulter [6]研究中的“中等”和“低”负载条件采用重复范围> 15 rm,包括重复连续体的“耐力”方面。此外,对较轻的负载条件进行的套数逐渐减少,这些研究提出了关于在肌肉耐久性的情况下是否显示出优势的问题,如果套装已经等同于体积负荷。目前尚不清楚为什么上肢和下肢之间存在肌肉耐久性的粘性差异,而相对于强度或肥大结果没有看到这种效果;需要进一步的研究来更好地理解这种明显的现象。 在解释证据时,重要的方法考虑与使用预干预或干预后1RM值有关。具体地,一些研究评估了在肌肉耐久性对不同加载方案对不同装载方案的影响使用预先干预(基线)1RM值来确定耐久性测试的负荷,而其他使用后介入性值[20,31]。例如,如果一组参与者在预介入测试中按100千克的平均1RM,则我们使用60%的1RM用于肌肉耐久性测试,负载将设定为60千克。但是,如果参与者在干预后的1RM增加到120公斤,那么初始测试中使用的60千克现在将达到新建立的1RM的50%,这将自然地改变一些生理需求测试。另一种选择是根据新建立的1RM重新调整干预后测试中的重量。在我们的示例中,干预后1RM为120千克,肌肉耐久性测试的新负载将设定为72千克。然而,这种方法的限制是它使测试中的值偏向低负载条件。如前所述,高负荷训练通常导致1RM的增加,因此还需要在肌肉耐久性评估中使用更高的载荷[10]。实际上,我们的组[20]在与中等-(8至12rm)载荷相比,在低(25至35 rm)的训练时,对相对上身肌肉耐久性(卧式压力机50%1rm)的提高表现出更大的改善。然而,后期后测试基于后期后1RM,可想象的偏置导致低负荷条件。或者,局部肌肉耐力测试基于研究前1RM的研究倾向于驳斥低负荷训练对这一结果的益处。Jessee等人[31]显示,在进行为期8周的训练计划(使用15%或70%1RM的负荷)后,在单侧膝盖伸展中,在测试前1RM的42.5%评估下,相对肌肉耐力也有类似的增加。最近,Buckner等人[79]发现,在试验前1RM的42.5%时使用肘关节屈曲来评估相对肌肉耐力,在高(70%1RM)和低(15%1RM)负荷条件下,负荷没有影响。鉴于使用预干预前的研究之间观察到的差异结果与干预后1RM值用于确定肌肉耐久性测试中的负载,未来的研究可以考虑使用两种测试方法。使用预先干预和干预后的肌肉耐力评估1RM值可能需要多天的测试,这可能会出现一些后勤限制。尽管如此,石头和Coulter的早期工作采用了这种方法[6]。在该研究中,当使用预先服用前1RM值时,所有基团都经历了肌肉耐久性的增加。然而,当将负载重新调整到干预后1RM值时,均未在上体内耐久性的增加,并且对于低体内,在6-8RM培训的组中发现显着增加(31%;〜11重复)和培训30-40rm的组(33%;〜10重复)。在15-20欧元的组培训中没有观察到显着差异,这将否定重复连续内提出的理论。 另一种选择是使用肌肉耐久性测试,不会受到1RM值变化的影响。例如,一项研究比较了培训对80%1rm的培训对培训的影响,培训具有40%的1RM [29]。参与者进行了一种等级试验,评估了总工作,被认为是肌肉耐力的代理。在这项研究中,40%1RM的团体培训经历了总工作的15%,显着大于80%1RM组(5%)中观察到的增加。因此,当使用等动力学任务中的总工作来测量肌肉耐力时,重复连续内容似乎有效。尽管如此,这一发现仅基于一项研究,突出了对未来研究的需求。比较重载和中等负荷训练的影响的研究表明条件之间肌肉耐久性的增加[21,24]。这表明对该主题缺乏剂量响应关系。因此,如果实际上存在对肌肉耐久性的负荷诱导的影响,这仍然是可疑的,它似乎仅限于重复连续体的远方方面。表3列出了对该主题的研究摘要。5.结论尽管普遍接受重复连续体作为加载范式,但目前的研究未能支持其一些潜在的推定。考虑到文学的身体时,可以绘制以下基于循证的结论,提出了用于锻炼处方的新装载范式(见图2)。 图2.电阻训练有关负荷特定适应的现有证据摘要。证据支持重复的连续uum关于使用动态恒定电阻运动的1RM测试造成的肌肉强度。这至少部分可以归因于测试在研究方案中使用的运动中通常进行测试,这提供了更好地转移与特异性原则一致的培训。或者,当在等距器件上进行测试时,在负载条件之间的强度相关的改进几乎没有差异。这些发现与运动表现有关的实际意义以及仍有仍有待开展日常生活活动的能力。关于肥大,文献的令人信服的身体表明,可以在宽的载荷范围内实现类似的整个肌肉生长(即肌肉厚度,CSA)〜30%1RM。这些发现与年龄和培训状况无关。因此,作为一个原则,没有理想的“肥大区”。然而,从实际的角度来看,鉴于光负荷训练与使用较重负载相比,既有载重量相比,可以提出适度负荷提供最有效的载荷手段,以便进行更多的重复,这又增加了培训的时间越来越多的重复。此外,伴随光载荷的高水平代谢酸中毒趋于引起不适[81],这又可以产生负面影响。或者,证据表明,重载训练需要更多的组,以实现相当的肥大到中等负荷。不仅从a效率低下时间立场,但高训练量的重负荷的组合提高了关节相关的应力,增加了过度训练的可能性。急性[40,41]和纵向[83-86]数据表明,与结构RT程序的一部分相结合的潜在的肥大益处,尽管调查结果的实际影响仍然是可疑的;需要进一步研究以吸引更强的课题结论。对局部肌肉耐久性的载荷特异性效果的证据仍然是等因力的。早期工作表明,在肌肉耐力的肌肉耐力训练的潜在益处,特别是在绝对地测试时。也就是说,这种效果的证据相当弱,似乎与下半身肌肉组织更相关。或者,研究调查负载对相对肌肉耐力的影响是相互冲突的,并且在大多数情况下,似乎并没有支持从重复连续统计中汲取的建议。总体而言,在妇女上有一个缺乏研究的主题。鉴于妇女具有更大的抵抗疲劳能力的证据表明,可以想到,在重复的连续体内可能存在性别特异性差异。未来的研究应该努力在用不同装载方案训练时确定在力量,肥大和与耐力相关的结果中的性别二态性的潜力。其余参考部分可至原网站产看  点击查看:查看文章上部分内容更多有生物学文章更多医学分类文章使用文档翻译功能  免责声明:福昕翻译只充当翻译功能,此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的,仅代表作者个人观点,与本网站无关,版权归原始网站所有。仅供读者参考,并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等,请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。  来源于:mdpi
2021-04-07 19:08:38
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许多朋友都因文献翻译这件事而头疼不已,经历过文献阅读的人都知道,大多文献不仅内容多,页数也很大……所以,如果自己翻译太费时,找人翻译太费钱了还不说也同样需要等待,本来就需要大量阅读才能找到的文献,在看不懂内容时,找人花钱翻译,发现不是自己需要的内容,那可真的是赔了夫人又折兵呀!其实翻译是有技巧的,可以先用机器翻译筛选文献内容,不仅成本低,而且翻译速度快,几十页几百页的文献分分钟就可以翻译成中文,然后在使用人工翻译要求高的内容,这样不仅节省时间还可以节省金钱。翻译步骤:使用 福昕翻译-文件翻译 功能,上传需要翻译的文件,然后在选择翻译需求。确定翻译需求、文件、语言,确认无误后点击 “开始翻译”立马就可以查看译文内容了!浏览译文:翻译后的内容可以在线查看,也可以下载操作。下面的图片是我用文档翻译后的内容对比,左边的是英文原稿,右边的是中文译文,可见原稿的格式和排版并没有发生变化,甚至字体的颜色也没有变化,这是下载后的译文。正常翻译效果是比较好的,当然了,如果你的文档在翻译之前是加密的,或者其他问题会影响到翻译流程,可能会影响到翻译后的内容,这样的情况一定要找客服询问处理,最后希望大家能顺利通过论文测试!点击查看:更多翻译功能教程
2021-03-10 19:58:14
文献翻译难?怎么使用靠谱翻译软件?
文献阅读一直是论文道路上重要且不可缺少的一步,因为它很可能影响你这次论文的主题、内容以及合格率,因此阅读大量的国内外文献也成为了论文编写者的日常,其中文献翻译就花费了大量的时间,更别谈阅读查找时间了,节省时间从文献翻译开始!怎么使用靠谱翻译软件?看完这篇文章相信你一定会有答案!文献翻译使用福昕翻译,为什么推荐福昕翻译?下图分别为官网的对比图。和实际文档翻译的对比图,很明显,原文的格式、样式、图片、甚至是文字的颜色在译后也没有被改变!福昕翻译官网文档翻译译后对比图 使用福昕翻译文档翻译功能翻译文献原文译文对比图使用步骤:打开福昕翻译官网,点击导航栏【文档翻译】,按照指示点击“免费上传”按钮上传需要翻译的文献,文档格式包括PDF、Word、 PPT、 Excel等,16种语言互译。接下来选择翻译的需求,确认译后的语言,最后点击【开始翻译】,将快速得到译文,可操作在线预览和译文下载,除了普通的译文还可以选择预览/下载双语译文(原文在上译文在下)。简单的操作就可以快速得到译文,几百页翻译分钟解决,让你轻轻松松阅读文献,记得收藏官网哦下次翻译不迷路!‍
2021-03-05 18:45:27
"TG":是主要人类呼吸道病毒的广谱抑制剂
Thapsigargin是主要人类呼吸道病毒的广谱抑制剂:冠状病毒,呼吸道合胞病毒和A型流感病毒 经过: 莎拉·贝塔吉(Sarah Al-Beltagi)克里斯蒂安·亚历山德鲁·普雷达利亚·古尔丁乔·詹姆斯Pu娟保罗·斯金纳江志敏王琳琳杨佳云阿什利C.肯尼斯·梅利兹帕维尔·格什科维奇(Pavel Gershkovich) 6,克里斯托弗·J·海斯乔纳森·阮·范·塔姆伊恩·布朗刘金华和张建洲1.诺丁汉大学动物医学与科学学院,萨顿·博宁顿,诺丁汉LE12 5RD,英国2.英国沃金GU24 0NF,Pirbright,Ash Road,Pirbright学院3.英国Addlestone KT15 3NB,Woodham Lane的Weybridge,动植物卫生局(APHA)4.中国农业大学动物医学院,农业部动物流行病学重点实验室,北京圆明园西路2号,北京1001935.英国诺丁汉萨顿博宁顿诺丁汉大学生物科学学院,LE12 5RD,英国6.英国诺丁汉大学公园诺丁汉大学药学院NG7 2RD,英国7.英国诺丁汉大学公园诺丁汉大学化学学院NG7 2RD,英国8.英国诺丁汉大学公园诺丁汉大学医学院NG7 2RD*应与之联系的作者。这些作者为这项工作做出了同等的贡献。 摘要:SARS-CoV-2和其他主要呼吸道病毒的长期控制策略除了明智使用有效疫苗外,还需要包括抗病毒药以治疗急性感染。虽然正在为大规模疫苗接种推出COVID-19疫苗,但针对任何疾病使用或开发的适量抗病毒药物证明了抗病毒开发的挑战。我们最近发现,无毒的毒胡萝卜素(TG)是肌腱蛋白/内质网(ER)Ca2 + ATPase泵的抑制剂,可诱导有效的宿主先天免疫抗病毒反应,从而阻止甲型流感病毒的复制。在这里,我们显示TG还可以在永生或原代人细胞中阻断呼吸道合胞病毒(RSV),普通感冒冠状病毒OC43,SARS-CoV-2和A型流感病毒的复制。 TG的抗病毒性能在抑制OC43和RSV方面显着优于瑞贝昔韦和利巴韦林。值得注意的是,TG在合并感染中对冠状病毒(OC43和SARS-CoV-2)和流感病毒(苏联H1N1和pdm 2009 H1N1)的抑制作用相同。酸稳定TG的感染后口服管饲法可保护小鼠免于致命的流感病毒攻击。结合其在主动感染之前或期间抑制不同病毒的能力,以及在TG暴露后至少48小时的抗病毒持续时间,我们建议TG(或其衍生物)是有希望的广谱抗SARS-CoV抑制剂-2,OC43,RSV和流感病毒。 关键字:毒胡萝卜素;抑制剂抗病毒物质; SARS-CoV-2;冠状病毒OC43;呼吸道合胞病毒;流感病毒广谱先天免疫;老鼠;瑞地昔韦利巴韦林;奥司他韦 1. 介绍在COVID-19大流行中,针对大规模疫苗接种的有效疫苗的需求从未如此大,以控制和预防可导致医院不堪重负的猖ramp的发病率,死亡率和激增的临床病例。 COVID-19是由一种新型冠状病毒引起的,该冠状病毒被称为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2),一种包膜的阳性单链RNA病毒[1]。尽管现在正在部署COVID-19疫苗,但根除是不切实际的,并且对有效抑制SARS-CoV-2抗病毒药[2,3]的平行需求存在着并行的需求,以抑制患者体内主动病毒复制以逆转病毒进程。考虑到并不是所有的疫苗都可以在随后的感染中预防病毒的脱落,因此抗病毒药也可以用来降低人群中传播的总体病毒水平,从而减少其传播。针对任何传染病使用或开发的抗病毒药物数量很少,证明了抗病毒药物开发的实际挑战。特别是对于呼吸道病毒,通常遇到的主要障碍是病毒突变抗性的出现,这种突变抗性源于直接针对病毒特定部分的普遍采用的策略。甲型流感病毒的N1部分对病毒神经氨酸酶抑制剂奥司他韦的耐药性日益引起人们的关注[4,5]。人们对令人担忧的是对新近引入的针对病毒PA蛋白的流感抗病毒药baloxavir marboxil的耐药性不断提高[6];甲型流感病毒的PB1基因中的突变很容易赋予对新型核苷类似物抗病毒药物favipiravir的耐药性[7]。可以潜在地规避病毒突变挑战的另一种抗病毒设计方法是,在早期感染期间调节通用的宿主固有免疫反应,以充分破坏病毒复制,从而建立获得性免疫(抗体和细胞介导的)。这种新颖的以宿主为中心的抗病毒方法可以具有抑制不同类型病毒的额外好处[8]。鉴于表现出不同病因的急性呼吸道病毒感染在临床表现上是无法区分的,因此可以同时针对不同病毒类型的广谱以宿主为中心的抗病毒药可能会大大改变临床管理。除了目前的SARS-CoV-2大流行外,甲型流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)仍然是造成人类呼吸道病毒感染的重要因素。流感病毒是包膜的负义分段单链RNA病毒,每年在全球范围内导致多达65万例死亡,并且是造成先前大流行的原因[9]。 RSV是一种包膜的负义单链RNA病毒,是幼儿和老年人急性下呼吸道感染的主要原因,与5岁以下儿童的院内死亡48,000–74,500相关,其中99%在发展中国家发生的死亡[10,11]。虽然在甲型流感病毒感染中使用抗病毒药可能会受到病毒抗药性的阻碍,但仅批准使用抗RSV的化学抗病毒药利巴韦林仅限于婴儿的严重感染[5,12]。我们最近显示,毒胡萝卜素(TG)是肌浆网/内质网(ER)Ca2 + ATPase泵的抑制剂[13],在纳摩尔非细胞毒性水平上诱导了有效的宿主抗病毒应答,从而阻断了甲型流感病毒的复制[14]。TG诱导的ER应激未折叠蛋白反应(UPR)似乎是激活宿主抗病毒防御下游谱的主要驱动力。在这里,我们显示TG实际上是一种以宿主为中心的广谱抑制剂,在永生或原代人类细胞中,可有效阻断RSV,普通感冒冠状病毒OC43,SARS-CoV-2和A型流感病毒的复制。我们还确定,胃中发现的TG是低pH稳定的,从一次引发起就能够快速诱导持续至少48小时的有效抗病毒状态,并且在小鼠口服后可在小鼠体内进行治疗性保护(体内)感染,应对致命的流感病毒挑战。 2. 材料和方法2.1. 细胞和病毒原代正常人支气管上皮细胞(NHBE)和支气管上皮生长培养基由Promocell(德国海德堡)提供。在添加了10%胎牛血清(FCS)的DMEM-Glutamax中培养无限增殖的新生猪气管上皮(NPTr)细胞[15],HEp2细胞,MRC5细胞,A549细胞,Calu-3细胞,Vero E6细胞和MDCK细胞。100 U / mL青霉素-链霉素(P/S)(Gibco,ThermoFisher Scientific,佩斯利,英国)。通过DEFRA分离出的人RSV(A2株,ATCC VR-1540),苏联H1N1(A / USSR / 77),PR8 / H1N1(A / PR8 / 1934)和pdm H1N1病毒(A / Swine / England / 1353/2009)这项研究使用了SwIV监视程序SV3401)。还使用了人冠状病毒OC43(OC43)和SARS-CoV-2病毒(2019-nCoV /意大利-INMI1株,从EVAg获得的进化枝V(008V-03893)),后者的完整序列已提交给GenBank(SARS-CoV- 2 / INMI1-Isolate / 2020 /意大利:MT066156),并且可以在GISAID网站上找到(betaCoV /意大利/ INMI1-isl / 2020:EPI_ISL_410545)。 2.2. 细胞活力测定根据制造商的说明,使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒或CellTiter-Glo 2.0细胞活力测定试剂盒(Promega,麦迪逊,威斯康星州,美国)确定细胞活力。 2.3. 细胞化学启动根据制造商的建议,将TG(美国密苏里州圣路易斯的默克公司)和瑞德昔韦(德国慕尼黑的Selleckchem公司)溶解在DMSO中,而利巴韦林和羟氯喹(默克公司)按照制造商的建议溶解在水中。化合物的抗病毒方案对细胞活力没有可检测到的不利影响。通常,除非另有说明,否则在感染前将细胞在适当的细胞培养基中稀释的所示化合物中孵育(稀释30分钟内使用),然后孵育30分钟,然后用PBS洗涤3次并用所示病毒感染(感染前启动)。或者,首先将细胞感染指定的时间,然后将化合物灌注30分钟,然后继续进行感染培养(感染后灌注)。细胞的所有TG引发仅持续30分钟,然后根据特定实验用PBS洗涤并进行下游培养。2.4. RSV感染和子代病毒定量HEp-2细胞,A549细胞和NHBE细胞根据24小时噬斑测定,在补充2%FCS的DMEM-Glutamax中以指定的RSV感染复数(MOI)感染48或72小时,收集的离心上清液用于噬菌斑测定或RT-qPCR的病毒拷贝数进行定量(请参见2.6节)。以前已经描述了通过噬斑分析对HEp2细胞进行RSV滴定[16]。简而言之,将感染细胞上清液的连续稀释液(一式三份)连续感染24小时的HEp2细胞固定在丙酮:甲醇(1:1)中,并使用小鼠抗RSV(2F7)抗体(1:1000)进行免疫染色(Abcam (英国剑桥)。2.5. 流感和冠状病毒的单一和共感染,以及子代病毒的定量甲型流感病毒感染需要无血清培养基和胰蛋白酶。 NPTr细胞和A549细胞的感染培养基是Opti-MEM I(Gibco),辅以100 U / mL P / S,2 mM谷氨酰胺和200 ng / mLL-1-甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮( TPCK)胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)。根据病灶形成试验(FFA),将特定的流感病毒MOI在感染培养基中感染细胞2到3 h,然后用PBS洗涤3次,并在新鲜感染培养基中孵育24天如图所示,持续72小时。收集纺丝上清液用于通过6 hFFA,50%组织培养物感染剂量(TCID50)或通过RT-qPCR的病毒拷贝数对子代病毒进行定量。以前已经描述了通过FFA滴定流感病毒[14]。在添加100 U/ mLP / S,2 mM谷氨酰胺和100 ng / mL TPCK胰蛋白酶的Opti-MEM I中,将A549细胞和MRC5细胞用指定的MOIOC43(基于FFA)感染OC43 3小时。用PBS洗涤3次,并在新鲜的感染培养基中孵育长达72小时。对用OC43和苏联H1N1病毒共感染的A549细胞进行了相似的处理。收集纺丝上清液用于通过FFA定量子代病毒或通过RT-qPCR定量病毒拷贝数。 在指示的MOI上,以TCID50为基础,用SARS-CoV-2将Calu-3,NHBE和Vero E6细胞感染,在补充有100U/mLP/ S,2 mM谷氨酰胺和100ng的Opti-MEMI中感染3 h。如图所示,将1mL / mL TPCK胰蛋白酶,随后在PBS中洗涤3次,并在新鲜的感染培养基中孵育总计长达72小时。对被pdm H1N1病毒和SARS-CoV-2病毒共感染的Calu-3细胞进行了相似的处理。收集纺丝上清液用于通过TCID50定量子代病毒或通过RT-qPCR定量病毒拷贝数。以96孔板形式进行TCID50滴定,以定量SARS-CoV-2和A型流感病毒,最少重复四次。在生长培养基DMEM(Gibco)中对每个样品进行十倍稀释。然后,将50µL稀释样品分别添加到MDCK和VeroE6细胞中用于流感和SARS-CoV-2滴定,并在37°C下孵育1 h。然后将培养基换成200 µL DMEM(补充200ng /mL TPCK胰蛋白酶用于流感滴定),并在37℃下孵育5天。在显微镜下评估每个孔的细胞病变作用。使用Spearman-Karber方法以TCID50计算病毒滴度[17,18]。检测限为5.62 TCID50 / mL。2.6. RNA制备和实时RT-PCRRNeasy Plus Minikit(Qiagen,希尔登,德国)用于从细胞中提取总RNA。使用Superscript III First Strand合成试剂盒(ThermoFisher Scientific)从1 µg总RNA合成cDNA。用LightCycler 96仪器(Roche,Basel,Switzerland)进行宿主基因的表达。基因表达的计算基于比较的Ct方法,已标准化为18S核糖体RNA。 HSPA5(FH1_HSPA5和RH1_HSPA5),HSP90B1(FH1_HSP90B1和RH1_HSP90B1)和DDIT3(FH1_DDIT3和RH1-DDIT3)的人ER应力引物;和人类IFNB1引物(FH1_IFNB1和RH1_IFNB1),OAS1引物(FH1_OAS1和RH1_OAS1)和RNASEL引物(FH1_RNASEL1和RH1_RNASEL1)是预先设计的Sigma-Aldrich。使用PrimerExpress 3.0.1(ThermoFisher Scientific)设计了其他引物(由Sigma-Aldrich合成),并在表1中显示。QIAamp病毒RNA试剂盒(Qiagen)用于从离心细胞培养上清液中提取病毒RNA。使用QIAGEN OneStepRT-PCR KIT进行一步实时qPCR,以定量相对病毒拷贝数。 表1.引物序列。 基因没有第一(5d – 3d)反义引物(5j–3j)18S核糖体RNA(通用)ACGGCTACCACATCCAAGGACCAATTACAGGGCCTCG-AAA F基因(RSV)CAAGAACTGACAGAGGATGGTACTGCATGTTTCAGCTTGTGGGAAGAL基因(RSV)AACACTTATCCTTCTTTGTTGGAACTTAGCAACCGAAACTCACGATAGAAAM基因(RSV)ACTCAAGAAGTGCAGTGCTAGCAAAGGACACATTAGCGCATATGGTRIG-I(人类)GAAGGCATTGACATTGCACAGTTGGTTTGGATCATTTTGATGACAM基因(苏联H1N1)AGATGAGCCTTCTAACCGAGGTCGTGCAAAAACATCTTCAA-GTCTCTGM基因(pdm H1N1)AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGTGCAAAGACACTTTCCA-GTCTCTGOrf1ab(SARS-CoV-2)CCGATCATCAGCACATCTAGGTTGACAAGGCTCTCCATCT-TACCTTTOrf1ab(OC43)GCCAGGGACGTGTTGTATCCTTGATCTTCGACATTGTGACCTATG 2.7. 蛋白质印迹使用放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(圣克鲁斯,达拉斯,美国德克萨斯州)补充1%苯基甲基磺酰氟(PMSF)(圣克鲁斯),1%抑制剂混合物和1%原钒酸钠,裂解细胞,并通过Bio-RAD蛋白质测定法(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)测量蛋白质浓度。一抗是1:500稀释的山羊抗甲型流感A1(Abcam,ab20910),小鼠抗甲型M2克隆14C2(1:1000)(Invitrogen,MA1082),山羊抗甲型流感病毒多克隆抗体以1:2000的稀释度(Abcam,ab155877),小鼠抗冠状病毒抗体OC-43株,克隆541–8F处于1:1000(Sigma-Aldrich,MAB9012)和小鼠抗β-肌动蛋白克隆AC- 74处于1:5000(Sigma-Aldrich,A2228)。合适的物种特异性二抗是过氧化物酶偶联的(Abcam),用于化学发光检测(Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent,美国马萨诸塞州马尔伯勒)。2.8. 干扰素-β(IFNβ)ELISA通过酶联免疫吸附测定(ELISA)定量细胞培养上清液中的IFNβ分泌。 IFNβELISA(人类IFN-βQuantikine ELISA试剂盒,美国明尼苏达州明尼阿波利斯市Bio-Techne)按照制造商的说明进行。样品进行三次重复分析。2.9. 小鼠流感病毒挑战为了评估TG在感染过程中(即感染后)的抗病毒效力,并与体内奥司他韦进行比较,将6至8周龄的BALB / c小鼠(雌性)分为两组,以确定感染后存活率(每个治疗组n = 8)和子代病毒产生(每个治疗组n = 8)。小鼠经鼻内感染了3个MLD50的PR8/H1N1病毒。感染后十二小时,每天通过管饲法口服TG(1.5 µg / kg /天),奥司他韦(45 mg / kg /天)或PBS + DMSO(PBS-DMSO对照中DMSO的百分率与其他治疗相当)天。在感染后第3和5天,收集每组四只小鼠的肺以进行病毒滴定。通过TCID50分析,对接种了10倍连续稀释的均质化肺组织的MDCK细胞进行病毒滴定,并在37°C下孵育72小时。 TCID50值是根据Reed–Muench方法[19]计算的。 2.10. 量化与统计分析使用GraphPad Prism 7和图例中描述的统计方法进行统计分析。 p值<0.05被认为是显着的,并表示为* p <0.05,** p <0.01,*** p <0.001和**** p <0.0001。 Kaplan–Meier方法用于生存分析。给出的结果代表了三个或更多个独立的重复,除非另有说明,否则误差线为标准偏差。2.11. 道德声明所有动物工作均已获得北京科学技术协会(ID:SYXK(Beijing)2007–0023)的批准,并按照北京实验动物管理委员会发布的《北京实验动物福利和道德规范》进行;符合中国农业大学机构动物护理和使用委员会指南(ID:SKLAB-B-2010–003)。3. 结果3.1. TG阻止子代RSV生产为了证明TG对RSV的抗病毒活性,在感染前24小时(图1A)或感染后24小时(hpi)(图1B)用TG短暂灌注人HEp2和A549细胞30分钟。每种细胞类型的感染前和感染后TG引发导致后代病毒产量显着下降(统计上显着)。感染前用0.5 µM TG引发的HEp2细胞将子代病毒的产生减少了近10,000倍(图1A);在24 hpi时用0.5 µM TG引发的细胞将病毒输出降低约1000倍(图1B),这分别表明其对RSV的预防和治疗抗病毒潜力。用TG对HEp2和A549细胞进行30分钟的单次启动诱导了有效的抗病毒状态,这种状态持续至少48小时(图1C,D)。 TG引发HEp2细胞(感染前即刻或感染前48小时)引发了病毒L,F和M基因的转录抑制(图1E,F)。所用TG的抗病毒方案对HEp2和A549细胞无细胞毒性(图1G,H)。补充证据TG的非细胞毒性抗病毒剂量方案已在我们较早的出版物中发现[14]。因此,TG作为一种非细胞毒性抑制剂具有快速作用,可在持续至少48小时的细胞中诱导抗病毒状态,并且在主动RSV感染之前或期间使用时是有效的。 接下来,根据被感染的HEp2细胞的后代病毒产量(图2A)和病毒RNA检测(图2B),将TG的抗病毒性能与病毒唑进行比较,利巴韦林是一种被批准用于严重RSV感染的幼儿的抗病毒药物。 TG在阻止RSV复制方面优于病毒唑。例如,用0.1µM TG感染HEp2细胞预感染30分钟对子代病毒产生的抑制作用比连续使用30 µM利巴韦林(50%利巴韦林有效浓度(EC50)对RSV = 11)高160倍。 µM [20])(图2A)。 TG在HEp2细胞的RSV抑制中表现出984的选择性指数(50%(CC50)/ EC50的细胞毒性浓度)和84.55 nM的EC90,这表明它具有很强的安全裕度(图2C,D)。在由TG引发和感染的原代NHBE细胞中,相应培养基中病毒RNA的检测降低(图2E)与病毒L,F和M基因的转录抑制(图2F)同时发生,这进一步表现为TG剂量依赖性减少病毒蛋白的产生(图2G,H)。 两者合计,TG作为抗病毒剂比利巴韦林更有效,表现出很强的选择性指数,并阻断了RSV病毒的转录和病毒蛋白的产生。在原代NHBE细胞中,相对于DMSO对照,在RSV感染之前和期间,TG依赖于TG的剂量以TG剂量依赖性的方式进行了TG的感染前致敏增强ER应激基因(DDIT3,HSPA5和HSP90B1)的表达(图3A,C)。TG还增加了NHBE细胞中RIG-I信号相关基因(RIG-I,IFNB和RNASEL)的基础表达,但是在感染过程中,相对于被感染的DMSO对照,RIG-I相关基因的诱导显着衰减(图3D,G)。因此,在NHBE细胞中RSV感染期间,RIG-I相关基因的转录诱导减少是一个特征。TG介导的RSV抑制作用。3.2. TG阻止子代冠状病毒OC43的生产为了证明TG对冠状病毒的抑制作用,在感染地方性OC43病毒之前,立即用TG引发A549细胞30分钟[21](图4A–C)。以剂量依赖性方式,TG阻断了病毒复制,如感染细胞的培养基中病毒RNA的急剧减少(图4A),病毒转录的抑制(图4B)和病毒NP蛋白生成减少(图4C)所证明。将TG的抗病毒性能与羟氯喹(HC)进行了比较,后者是一种毒性比氯喹低的化合物,可抑制OC43[22]。 TG在阻止子代OC43病毒产生方面比HC更有效(图4D,E)。感染前引发与整个感染过程中连续使用20 µM HC相比,0.05 µM TG仅持续30分钟对OC43的抑制作用更大(针对SARS-CoV-2的HC EC50 = 4.51 µM [23])(图4D)。与HC处理后代病毒的适度减少不同,在TG引发的感染细胞的培养基中几乎未检测到任何病毒(图4E)。在A549细胞中,TG在阻止OC43病毒(图4F)和流感病毒(图4G)复制方面比最近被批准用于SARS-CoV-2感染紧急使用的核苷类似物Remdesivir(RDV)[24]更好。 。尽管在72hpi时,细胞连续暴露于0.3 µM RDV(RDV EC50对OC43 = 0.15 µM [24])显示约17,000倍减少子代病毒RNA的检测(相对于相应的DMSO对照);细胞反过来,用0.3 µM TG引发的细胞则比RDV处理过的细胞具有450倍的抑制作用(图4F)。在72 hpi时,与0.3μM的RDV连续使用相比,0.05μMTG引发的细胞对苏联H1N1病毒的抑制作用还强于7倍。 RDV对流感病毒复制几乎没有抗病毒作用(图4G)。 TG在A549细胞中的抗病毒用途无细胞毒性(图4H)。 TG在MRC5细胞中OC43上的TG的选择性指数(CC50 / EC50)高,介于7072和9227之间(图4I)。总的来说,TG强烈抑制OC43病毒的转录和蛋白质产生,作为抗病毒剂比HC和RDV更有效,并且具有较高的选择性指数。 点击:查看文章剩下部分 查看更多医学文章 查看更多冠状病毒文章 使用专业文章翻译功能免责声明:福昕翻译只充当翻译功能,此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的,仅代表作者个人观点,与本网站无关,版权归原始网站所有。仅供读者参考,并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等,请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。 来源于:mdpi
2021-02-24 16:25:36
咖啡及其成分对胃肠道和脑肠轴的影响(结论)
3.5.美拉德反应产物:黑色素和丙烯酰胺我们小组进行的另一项胃肠运动的影像学研究评估了先前提到的咖啡银皮水提物中黑色素的作用[178]。咖啡银皮是咖啡豆外层的皮料,约占咖啡樱桃的4.2%(w / w),是咖啡烘焙过程中产生的唯一副产品[179]。咖啡银皮已被提议作为益生元,抗氧化剂和膳食纤维的可持续天然来源[180]。咖啡银皮提取物的抗氧化特性是由于CGA的存在[181],也归因于黑色素在烘烤过程中产生的[182]。黑色素是在美拉德反应的最后阶段产生的高分子量棕色聚合化合物[183],而衍生自咖啡的那些被称为“美拉德化膳食纤维” [184]。因此,在健康的雄性Wistar大鼠中,以1 g/ kg的饮用水剂量在体内研究了纤维效应。 4周后,大鼠通过管饲法接受硫酸钡,然后在0-8小时后拍摄X光片。另外,进行结肠珠排出试验以具体确定对结肠推进的可能影响。与先前关于SCG的研究一致,黑色素加速了小肠的转运(因为暴露于黑色素的大鼠中盲肠的到达速度明显快于对照动物),并且倾向于加速粪便颗粒的形成,尽管这种作用并不明显。有趣的是,来自黑色素组的粪便颗粒倾向于稍大,这可能是由于该组中较高的纤维摄入量所致,从而使粪便颗粒在机械刺激结肠方面稍微更有效。此外,黑色素没有显着改变插入结直肠3 cm的珠子的排出潜伏期,表明在此水平上参与结肠推进的运动因子(内在和外在神经支配,平滑肌和ICC)没有改变。饮食接触咖啡银皮产生的类黑素,它们可能被用作功能性食品成分[178]。有趣的是,Argirova等。 (2010)[185]表明,黑素能作用于肌张力,并可能促进Ca2 +流入分离的胃肌层细胞。因此,这些化合物不仅可以通过纤维作用,而且可以通过胃肠道平滑肌细胞的直接活化来发挥其促动力作用,这需要使用分离的肠道肌肉组织来证实。如上所述,丙烯酰胺是由于之间的美拉德反应而形成的。加热过程中的氨基酸和糖[186],也发生在咖啡烘焙过程中。尽管很难评估人体中丙烯酰胺的饮食摄入量,但一般人群的估计饮食摄入量为每天0.3-0.8 µg /kg体重[187]。这是由于不仅暴露于咖啡,而且还暴露于可能也含有丙烯酰胺的其他食品(薄片,谷物)和工业产品(与聚合物,胶水和纸张有关的那些,水处理和化妆品工业[126])。相关浓度会影响人类健康。尽管消化道是丙烯酰胺吸收的主要途径之一,而且包括咖啡在内的含丙烯酰胺食物的摄入量仍在增长,但几乎没有评估其对ENS神经元的作用,但这很重要因为丙烯酰胺是周围神经系统的毒素。在肠道肌层神经元,平滑肌细胞和神经胶质细胞的共培养模型中研究了丙烯酰胺的影响[188]。在这项研究中,将丙烯酰胺以0.01 mM至12 mM的剂量添加到共培养物中,然后孵育24、96或144 h。与肉毒杆菌毒素A(也在同一系统中进行测试并且仅改变神经元功能)相反,当以0.5–2mM的剂量使用时,丙烯酰胺会破坏肠道神经元结构。在这些剂量下,损伤对轴突结构是选择性的,而不影响存活,而在较高剂量下,神经元的存活显着降低。轴突丢失伴有乙酰胆碱释放减少,这在4 mM时可忽略不计。该机制涉及突触囊泡的合成和功能,但不涉及胆碱的摄取。高剂量的神经元损失主要涉及坏死机制,尽管也证实了非胱天蛋白酶3介导的凋亡死亡的频率较低。有趣的是,还显示出在低剂量丙烯酰胺攻击后,轴突再生是可能的。实际上,在低剂量攻击后的24-96小时内,轴突的生长比对照培养的细胞更快,这表明在最初的破坏性侵害之后,补偿机制的参与。但是,发现神经递质的释放至少要延迟几天才能到达轴突再生长。有趣的是,所描述的所有变化都对神经元具有选择性(与潜在的表型无关),肠神经胶质细胞显然未受到影响[188]。口服给实验动物后,丙烯酰胺也被证明对ENS产生神经毒性作用。早期研究显示ENS的变化,丙烯酰胺治疗的大鼠类似于链脲佐菌素诱导的糖尿病动物,但儿茶酚胺能含量发生改变,降钙素基因相关肽(CGRP)的量减少,血管活性肠肽(VIP)水平相应增加[189]。但是,这些研究并未评估这些变化是否与神经元丢失,轴突变性或功能改变有关。最近,已经在猪模型中研究了丙烯酰胺给药的作用。结果表明,即使低剂量的丙烯酰胺也会影响胃肠道的结构和功能,并引起ENS神经元的显着反应。例如,可卡因和苯丙胺调节的转录本(CART)的表达在应激刺激和神经保护的神经元反应中起着至关重要的作用,特别是在接受低剂量的未成熟母猪的小肠肌层丛中或通过口服途径高剂量的丙烯酰胺治疗28天,这被解释为是对这种病理刺激作出响应的胃肠道神经元保护/恢复过程的一部分[190]。甘丙肽是另一种具有神经保护作用的肽,可调节神经损伤后的存活或再生并发挥抗炎活性[191,192]。因此,在相同的猪模型中,即使在低剂量下,胃中粘膜下层和肌间神经丛的甘丙肽样免疫反应神经元的数量也会增加。此外,对甘丙肽具有免疫反应性的同时对VIP,nNOS或CART具有免疫反应性的细胞的粘膜下层和肌层神经元细胞也有所增加。作者再次将这些发现解释为甘丙肽的神经营养/神经保护作用(可能与VIP,nNOS和CART协同作用)在丙烯酰胺中毒后胃ENS的恢复过程中[193]。该系列的另一篇论文于2019年发表,在猪十二指肠中发现了相似的结果。与以前一样,通过口服途径以低剂量(0.5 µg / kg)的每日剂量使用丙烯酰胺,或以10倍剂量(5 µg / kg)的口服途径使用丙烯酰胺4周。两种治疗均导致对P物质(SP),CGRP,甘丙肽,nNOS和囊泡乙酰胆碱转运蛋白(VACHT)免疫反应的神经元百分比显着增加,尽管高剂量会引起更强烈的变化。在这种情况下,作者给出的解释是,所有这些变化可能都是补偿性的塑性作用,试图保护神经元免受损害并恢复肠道神经元稳态[194]。值得注意的是,尽管丙烯酰胺会在体内和体外激活小胶质细胞,从而导致促炎性细胞因子的释放,并因此导致神经元损伤[195],但肠神经胶质细胞参与由丙烯酰胺诱导的肠道神经元改变尚无明确报道。除上述研究使用肠肌神经元神经元,平滑肌细胞和神经胶质细胞共培养,并且在最后一种细胞类型中未显示任何丙烯酰胺诱导的改变外,尚未进行评估[188]。4.咖啡和脑肠轴如前所述,咖啡是化合物的天然来源(图4),能够在脑肠轴上发挥关键作用[196]。有趣的是,在Pubmed中将“脑肠轴”和“咖啡”组合为关键字时,仅检索了三篇论文(截至2020年11月29日),其中两篇以咖啡与PD的关系为主导(请参见下文)[ 197,198]。另一个是Papakonstantinou等人最近的一项研究。[199],他对40位健康的年轻人(20-55岁)进行了一项随机,双盲,交叉的临床试验(ClinicalTrials.govID:NCT02253628),以研究200毫升含160毫升咖啡饮料的效果mg咖啡因(冷热速溶咖啡,冷浓缩咖啡,热过滤咖啡)对(1)自我报告的胃肠道症状,(2)唾液胃泌素,(3)压力指数(唾液皮质醇)和α-淀粉酶)和心理测量,以及(4)血压。重要的是,参与者是每天的咖啡消费者,并且该研究是在无压力的情况下进行的条件。咖啡对自我报告的焦虑水平没有影响。此外,参与者在与胃肠道阴性症状(例如,腹部不适,腹胀,消化不良和胃灼热),慢性压力和负面情绪有关的所有问题中均得分很低(十分之1),而得分较高(10分钟有9分)关于积极情绪的所有问题。饮用咖啡后,唾液中的α-淀粉酶活性显着提高,仅在摄入后15分钟和30分钟时冷速溶咖啡和过滤后的咖啡之间存在显着差异。不论咖啡类型如何,唾液胃泌素暂时增加,而唾液皮质醇或自我报告的焦虑水平不受影响。但是,在实验期结束时,血压显着升高(但在健康的生理水平内),与咖啡的类型/温度无关。尽管许多研究已经解决了咖啡和咖啡因对心血管和中枢的影响,但Papakonstantinou等人的报告指出。似乎是唯一一项在相同的个体和相同的条件下专门评估它们对整个脑-肠轴影响的研究。因此,证明了在非压力条件下的急性咖啡摄入与胃肠道症状无关,但激活了交感神经系统,与唾液中的α-淀粉酶和血压升高有关,但与唾液皮质醇无关,这被认为是由于可能是咖啡的抗应激作用[199],可能是咖啡因以外的其他咖啡化合物造成的。因此,重要的是,不仅要研究咖啡,还要研究其成分对脑肠轴的影响。图4.咖啡化合物对脑肠轴的影响。缩写:CGA,绿原酸; GABA,γ-氨基丁酸。 4.1.咖啡因咖啡因是咖啡中发现的主要精神活性化合物(表1)。它是从饮食中摄取并吸收到血液中,刺激交感神经系统活动,并容易穿过血脑屏障(BBB),对中枢神经系统(CNS)也具有刺激作用[196,200]。咖啡因通过调节不同的神经元途径对中枢神经系统有影响。因此,在动物和人体研究中,都发现咖啡因暴露后多巴胺能系统发生了变化[201]。不同的研究表明,咖啡因会增加细胞外多巴胺的浓度[202],以及多巴胺能受体和转运蛋白的表达[203],从而导致认知功能障碍和注意力的改善[204]。此外,据报道,咖啡因能够抵抗多巴胺能神经元的丧失,在动物模型中诱导神经保护并减轻神经系统疾病[205],这在PD的背景下可能特别有用。(见下文)。然而,精神分裂症和成瘾中的多巴胺能活性增加。因此,在这些患者中也必须考虑咖啡和咖啡因的作用。重要的是,由于不同的原因,精神分裂症患者的咖啡和咖啡因摄入量相对较高,包括缓解无聊和冷漠的意愿或抗精神病药物的副作用,如镇静或口干[206]。通常,建议这些患者减少咖啡消耗量[207]。另一方面,据报道咖啡因和谷氨酸能信号传导之间可能存在相互作用。长期摄入咖啡因可减轻成年雄性C57BL / 6小鼠的胚细胞诱导的记忆障碍,这与在损伤的不同阶段对谷氨酸兴奋性毒性,炎症,星形胶质增生和神经元丢失的神经保护作用相关[208]。此外,摄入咖啡因还可以减少海马中谷氨酸能神经末梢的丧失,从而恢复糖尿病引起的小鼠记忆功能障碍[209]。此外,发现咖啡因会降低γ-氨基丁酸(GABA)能量系统的活性并调节GABA受体,从而导致神经行为效果[201]。长期摄入咖啡因可能与GABA的长期减少有关[210]。最后,Jee等人的最新评论。 (2020)指出,咖啡因的摄入对男性和女性都有不同的神经和精神病学影响[211],突出了评估性别对咖啡及其成分对脑肠轴影响的影响的重要性。特别是,作者表明,摄入咖啡因可降低女性中风,痴呆和抑郁症以及男性PD的风险。然而,咖啡因对男性和女性青少年都有增加睡眠障碍和焦虑增加有负面影响[211]。4.2.多酚类咖啡也是CGA(表1)的来源,CGA是一种羟基肉桂酸,具有抗氧化、抗菌和抗炎等促进健康的作用[212]。大多数摄入的CGA被水解为CA和奎宁酸,并被肠道微生物群进一步代谢为各种芳香酸代谢物[213]。关于CGA及其代谢物穿越血脑屏障的能力存在争议[214215]。然而,由于其抗氧化和抗炎特性而产生的神经保护作用之前已经被描述过[215]。正如咖啡因所提到的,CA和CGA是具有抗氧化特性和对多巴胺能神经毒性具有神经保护作用的咖啡成分[216,217],已被认为是降低与咖啡消费有关的PD风险的基础[218,219]。有趣的是,PD的主要症状之一是便秘,似乎在PD运动症状出现前10-20年已经出现[220],较低的排便频率预示着未来的PD危机[221]。此外,PD患者和动物模型中会发生神经变性,有力的证据表明PD可从ENS开始并通过迷走神经从那里扩散到CNS [222,223]。在最近的报告中,在鱼藤酮诱导的PD小鼠模型中测试了CA或CGA [224]。在该模型中,将小鼠皮下植入一个渗透微型泵,以2.5mg/kg /天的剂量给予鱼藤酮(相当于通过农药暴露于鱼藤酮的环境水平),持续4周。从鱼藤酮暴露前的第一个星期开始,直至暴露结束,每周5天施用CA(30mg/ kg/天)或CGA(50 g/ kg /天)。处死后评估治疗对中枢多巴胺能和肠神经元的作用,并在鱼藤酮治疗结束后1天进行治疗。此外,将大鼠肠神经元和胶质细胞的培养物暴露于鱼藤酮(1-5nM)或不暴露于CA(10或25 µM)或CGA(25 µM)。值得注意的是,除了对与PD相关的中心结构和细胞(即,黑色素多巴胺能神经元)产生有益影响外,和星形胶质细胞),这证明了CA或CGA的施用至少部分地阻止了鱼藤酮诱导的变化,鱼藤酮既影响了治疗小鼠肠肌层神经丛的神经元,也影响了肠神经胶质细胞。重要的是,所有这些作用均在体外复制。确切的机制尚不清楚,但有人建议CA和CGA预处理或CGA预处理可以增强神经胶质细胞的活性,从而响应鱼藤酮的暴露而产生抗氧化分子。尽管所使用的CA和CGA剂量可能比喝咖啡的人每天摄入的CA和CGA剂量高2-5倍,但结果显然令人鼓舞。实际上,作者建议,尽管CA和CGA对胃肠蠕动的影响,也许有可能使用一种以食物为基础的有前途的神经保护治疗策略来改善PD的运动症状和非运动症状,例如便秘。在本报告中未作具体评估[224]。在编写此手稿的最后阶段,Rogulja小组发表了一份报告[225],该报告显示,睡眠的有益效果与肠道健康之间有着关键的联系。他们证明严重的睡眠不足会导致果蝇和小鼠的肠道(而非大脑)中的ROS积累,这与果蝇的死亡有关(睡眠受限的短暂周期无法证明这一点)也在老鼠中)。重要的是,可以通过口服抗氧化剂化合物或通过抗氧化剂酶的肠道靶向转基因表达来预防所有这些作用。许多人使用含咖啡因的咖啡来保持清醒,尽管咖啡因可能有助于失眠[211],但咖啡的抗氧化剂成分(如褪黑素,这是Rogulja和合作者在上述研究中使用的抗氧化剂之一,[225])可能会阻止积聚。避免肠道中的ROS,避免自愿睡眠限制的有害作用。4.3.氨基酸及其衍生激素天然存在于咖啡中的化合物之一是色氨酸(Trp),它是饮食中必须提供的必需氨基酸。色氨酸通过钠依赖性中性氨基酸转运蛋白,钠依赖性中性氨基酸转运蛋白(B0AT-1)吸收,需要通过与血管紧张素转化酶2(ACE2)的相互作用来稳定色氨酸[226]。色氨酸的吸收导致分泌α-防御素,富含半胱氨酸的阳离子肽,对多种细菌和其他微生物具有抗生素活性,从而使饮食中的Trp成为肠道菌群稳态所必需的[227,228]。重要的是,Trp的异常吸收(可能是由于慢性应激期间ACE2的细胞表面下调所致[229]或被严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)[230]感染)导致的表现结肠炎,例如腹泻[231]。这种氨基酸对于维生素B3(烟酸)的合成也是必不可少的,这种维生素的缺乏会导致糙皮病,这种疾病的特征在于腹泻,炎症和蛋白质营养不良,并伴有皮肤和中枢神经系统表现[232]。重要的是,最近的研究还表明,烟酸缺乏症可能与阿尔茨海默氏症,帕金森氏症和亨廷顿氏症有关;认知障碍;或精神分裂症[232]。一旦Trp被消化道吸收并从肠道吸收,它就可以在循环中使用(大部分结合白蛋白)并穿过BBB参与CNS中的5-羟色胺合成[233,234]。血清素是一种神经递质,可调节不同的生理方面,例如行为,学习,食欲和葡萄糖稳态[235]。全身5-羟色胺的百分之五是脑源性的[235],而大多数5-羟色胺(95%)是由胃肠道ECs中的Trp产生的[233]。 EC在胃肠道粘膜中充当感觉转导成分。进食,腔内扩张或传入迷走神经刺激后,EC释放5-羟色胺,其主要靶点是包括迷走神经在内的初级传入神经元的粘膜投射[236]。膳食和外周血清素不能穿过血脑屏障,这意味着与脑源性血清素相比,外周血清素具有不同的功能[235]。外周血清素通过作用于胰腺参与葡萄糖和脂质稳态的调节肝细胞和白色脂肪细胞上的β细胞[235]。血清素也参与内脏疼痛,分泌物的分泌和蠕动反射的调节,并改变在许多不同的精神疾病中也可以检测到这种激素的水平。某些胃肠功能紊乱的症状可能是由于中枢神经系统活性失调,外周水平(肠)失调或通过神经内分泌免疫刺激而两者结合(脑肠轴)引起的。另外,一些研究表明血清素在肝脏中的促纤维化作用,表明它与血小板衍生的生长因子协同作用可刺激肝星状细胞增殖[237]。从大脑中Trp合成的另一种神经递质是褪黑激素[238]。褪黑素在昼夜节律的控制中起着至关重要的作用,它还是一种强大的自由基清除剂和抗氧化剂[239]。咖啡是褪黑激素的来源,但该化合物在人体中的生物利用度较低(约3%)[240],咖啡因可降低内源性夜间褪黑激素水平[238],对睡眠时间和睡眠质量有重要影响[211]。 ]。GABA是CNS的主要抑制性神经递质,通常在许多大脑区域中以高浓度存在。在绿色咖啡豆中也可以找到它(表1)。尽管尚不清楚GABA穿过BBB的能力[241],但其止痛,抗焦虑和降压特性可能是由于对胃肠道受体,循环GABA或一定量的GABA可能通过胃肠道的局部作用所致。 BBB [196,242]。4.4.美拉德反应产物:黑色素膳食纤维和黑色素(后者也称为美拉德化膳食纤维[184])同样存在于咖啡中(表1),并在肠道甚至大脑中具有促进健康的特性。膳食中的黑色素与纤维相似,可以逃避胃肠道的消化,到达结肠,并成为肠道菌群的底物[243]。在肠道中,膳食纤维会增加粪便体积,有助于正常的肠功能和加速肠道运输[244]。不可消化的碳水化合物被微生物群发酵成SCFA,这些代谢物被归因于几种健康影响[196]。奇怪的是,对雄性Tsumura Suzuki肥胖糖尿病(TSOD)小鼠(一种代谢综合征的公认小鼠模型)进行的研究表明,咖啡因和CGA在每天服用这些化合物16周后,改善了血浆SCFA的分布。但是,在这项研究中,咖啡没有任何作用,可能是因为咖啡成分中的膳食纤维含量因品牌而异[245]。SCFA影响胃肠道上皮细胞的完整性,葡萄糖稳态,脂质代谢,食欲调节和免疫功能,并能够穿过血脑屏障[246]。有趣的是,人类研究报告称,膳食纤维可以从SCGs中分离出来,并具有生时作用[247],除了可以促进短期食欲和减少能量消耗[248]。此外,最近对14位健康受试者进行的一项随机交叉研究报告说,早餐时食用的咖啡类黑素减少了每日的能量摄入并调节餐后血糖和其他生物标志物[249]。5.结论咖啡是许多化合物的复杂可变混合物,其作用可能根据其来源,加工,生物利用度以及可能的协同和/或拮抗作用而变化。流行病学研究表明,咖啡冲泡可能对消化道产生多种影响,包括对粘膜的抗氧化剂,抗炎和抗增殖作用以及对肌肉层的促运动作用。但是,与其他人体系统和功能(即心血管系统,CNS)已知的形成鲜明对比的是,迄今为止积累的有关咖啡和特定咖啡衍生化合物对胃肠道整体或胃肠道影响的知识尽管胃肠道是第一个与摄入咖啡接触的身体系统,但事实上,整个器官中的不同器官以及对整个肠道壁中不同细胞类型所发挥的特定作用机制都非常缺乏。 。此外,咖啡及其衍生物对脑-肠轴健康(从情绪到神经变性)的影响直到最近才得到解决。咖啡被公认为是全球最受欢迎的饮料之一,也是交易量最大的产品,每天有数百万人消费咖啡[250]。此外,咖啡厂Coffee sp.。提供的功能远远超过传统饮料,其副产品,包括咖啡花,树叶,果肉,果壳,羊皮纸,生咖啡,银皮和SCG,已成为新功能食品的诱人潜在原料来源[251] 。希望,目前对咖啡和咖啡副产品的浓厚兴趣将有助于获得有力的科学证据,以阐明其在胃肠道中促进健康的特性的作用和作用机理。此外,有针对性的功能性食品可能很快就会开发出来,以专门保护或改善胃肠道和脑肠轴的健康。 作者贡献:概念化,R.A .;写作-原始草稿,A.I.-D.,J.A.U.,M.D.d.C.,R.A .;写作-审查和编辑,R.A。和M.D.d.C .;资金获取,R.A。和M.D.d.C.所有作者均已阅读并同意该手稿的发行版本。资金:项目“咖啡行业可持续发展的新知识”由法国国家调查委员会(CSIC)资助(201970E117); “针对结肠直肠癌患者的风险状况和全球福祉的新成分和有益食品的生产(TERATROPH,IDI-20190960)”和“新型咖啡副产品饮料,可实现脑肠轴的最佳健康( COFFEE4BGA)”由科学和创新部(PID2019-111510RB-I00)资助。机构审查委员会声明不适用。知情同意声明不适用。数据可用性声明数据共享不适用。致谢感谢YolandaLópez-Tofiño和Gema Vera在记录X射线图像和整个图像时所提供的技术帮助。利益冲突作者宣称没有利益冲突。缩略语[Ca 2+ ] i细胞内游离Ca 2+5-CQA5-O-咖啡酰奎尼酸ACF异常隐窝灶ACE2血管紧张素转换酶2层次分析法超极化后AKTAP丝氨酸/苏氨酸激酶Akt动作电位资料库蛋白激酶BATF-2激活转录因子2ATF-3激活转录因子3B 0 AT-1BBB钠依赖性中性氨基酸转运蛋白血脑屏障是巴雷特食管认证机构咖啡酸钙2+cAMP环磷酸腺苷单磷酸钙大车可卡因和苯丙胺调节的转录本注册会计师绿原酸CGRP降钙素基因相关肽国际会议钙诱导的钙释放中枢神经系统中枢神经系统COX-2环氧合酶2品质保证咖啡酰奎尼酸CRC大肠癌C反应蛋白C反应蛋白工商管理硕士二甲基苯并蒽DSS葡聚糖硫酸钠欧共体肠嗜铬细胞EGFENS表皮生长因子肠神经系统ERKf-EPSP细胞外信号调节激酶,快速兴奋,突触后电位加巴γ-氨基丁酸格尔德胃食管反流病GSK3βGST糖原合酶激酶3β谷胱甘肽S-转移酶他苏木精/曙红HIF-1缺氧诱导因子1HO-1血红素加氧酶-1HSP 70IARC热休克蛋白70国际癌症研究机构IBD炎症性肠病国际刑事法院卡哈尔间质细胞IKKIkB激酶白介素白介素iNOS诱导型一氧化氮合酶JNKMAPKMcl-1MCP-1c-Jun N-末端激酶促分裂原活化蛋白激酶髓样细胞白血病1甲基接受趋化蛋白-1SAPK应激激活蛋白激酶梅克·明格MAPK / ERK激酶N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍MP肠神经丛ND没有检测到核因子-kβ核因子-kβ氮氧化物一氧化氮合酶没有一氧化氮NR没有报告PAI-1纤溶酶原激活物抑制剂1局部放电帕金森氏病PTENPG磷酸酶和张力蛋白同源前列腺素PhIP2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5- b ]吡啶ROS活性氧RP静息潜力RyRryanodine受体层次分析法超极化缓慢SARS-CoV-2严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2美国足协短链脂肪酸SCG用过的咖啡渣EPS缓慢的兴奋性突触后电位SMP粘膜下丛SPP物质spp。STAT5TNF-R物种信号转导子和转录激活子5肿瘤坏死因子受体坏死因子肿瘤坏死因子TOPK色氨酸淋巴因子激活的杀手t细胞起源的蛋白激酶样蛋白色氨酸UDPUGT1A尿苷二磷酸UDP葡萄糖醛酸转移酶VACHT水泡乙酰胆碱转运蛋白血管内皮生长因子血管内皮生长因子贵宾血管活性肠肽WHO世界卫生组织ZO-1zonulin-1参考文献(可至原文查看)1. 鲁米斯,D。 K.Z. 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2021-01-28 18:38:54
人类冠状病毒:病毒与宿主相互作用的综述(下)
人类冠状病毒:病毒与宿主相互作用的综述(上) 7.人冠状病毒与NF-κB途径NF-κB蛋白是转录因子家族,可调节基因表达以控制广泛的生物学过程,例如细胞死亡,炎症,先天性和适应性免疫反应。哺乳动物的NF-κB家族由五个成员组成,即RelA(也称为p65),RelB,c-Rel,NF-κB1p50和NF-κB2p52,它们在细胞质中形成二聚体。已经确定,病毒病原体经常靶向NF-κB途径以增强病毒复制,宿主细胞存活和宿主免疫逃避[199,200]。 NF-κB信号传导的主要途径有两种:经典途径和非经典途径。在经典途径中,潜在的NF-κB与抑制剂IκB蛋白形成复合物,并被隔离在细胞质中。如上所述,病毒病原体的存在会激活各种膜传感器,例如RIG-I,后者会诱导IκB激酶(IKK)复合物磷酸化IκB,并随后引起泛素化。 IKK复合物由三聚体亚基组成,包括两个催化亚基IKKα和IKKβ,以及调节亚基IKKγ(也称为NF-κB基本调节剂或NEMO)。因此,NF-κB从IκB的抑制作用中释放出来并转移到核中,在核中,它可以单独或与其他转录因子(包括AP-1,Ets和Stat)组合刺激靶基因的转录[201]。另一方面,非经典途径与IκB降解无关,而是依赖于可诱导的p100加工。 NF-κB诱导激酶(NIK)(一种MAPKKK)的激活可诱导IKKα二聚体复合物的磷酸化和激活,进而激活p100。这导致p100螯合释放p52 / RelB异二聚体。 p52 / RelB异二聚体易位至细胞核,以激活与许多细胞功能有关的靶基因,特别是细胞增殖,存活和先天免疫[202]。7.1.NF-κB途径的调节NF-κB途径已被证明在HCoV感染中起重要作用。重组SARS-CoV感染小鼠的肺中NF-κB被激活[203]。但是,在同一项研究中,随后用NF-κB抑制剂对这些感染的肺细胞进行处理不会影响病毒滴度,但会降低TNF,CCL2和CXCL2的表达,因此表明NF-κB对于SARS-CoV介导的SAR诱导是必不可少的。促炎细胞因子[203]。还显示出HCoV-229E介导外周血单核细胞(PBMC)中的IL8诱导,可被NF-κB抑制剂减弱[204]。 NF-κB的调节是通过HCoV的几种病毒蛋白介导的(图5)。7.1.1.结构蛋白在SARS-CoV中,已证明S,M,E和N结构蛋白会干扰NF-κB信号传导。最近的一项研究报道了用纯化和重组的SARS-CoV S蛋白处理过的PBMC中增强的核NF-κB活性。这些S蛋白处理过的细胞中IL8的合成和分泌可以被NF-κB抑制剂抑制,因此表明NF-κB调节了这些细胞中促炎性细胞因子的水平[204]。SARS-CoV S蛋白可能通过上游蛋白激酶C(PKC)同工酶PKCα的上调刺激NF-κB,因为S激活的ERK和JNK是PKC依赖性的[192]。尽管SARS-CoV E蛋白不能促进IL8的合成和分泌[204],但重组SARS-CoV中E蛋白的缺失会降低NF-κB的激活[203]。此外,SARS-CoV N蛋白的过表达在VeroE6细胞中以剂量依赖性方式显着增加了NF-κB荧光素酶的活性,但在Vero,HeLa和Huh-7细胞中却没有,这表明这种NF-κB的诱导可能是细胞-具体[205,206]。另一方面,免疫共沉淀实验表明,SARS-CoVM蛋白与IKKb物理结合,将其隔离在细胞质中,从而抑制了NF-κB的活化[207]。然而,尽管我们不能排除可能涉及某些其他结构或非结构性MERS-CoV蛋白的可能性,但MERS-CoV M蛋白并不影响由具有NF-κB结合位点的启动子控制的荧光素酶活性[133]。 。对于HCoV-OC43,除非受到TNFα的刺激,否则仅表达其N蛋白就无法激活NF-κB。 NF-κB活化的增强是通过HCoV-OC43 N与microRNA9的相互作用来抑制的NF-κB[208]。7.1.2.非结构蛋白和辅助蛋白以前,已证明SARS-CoV nsp1的过度表达可诱导NF-κB活化,而HCoV-229Ensp1则不能[138]。 NF-κB抑制剂的使用以剂量依赖的方式抑制SARS-CoV nsp1诱导的趋化因子表达[209]。在SARS-CoV和MERS-CoV的nsp3中发现的PLpro结构域可拮抗IFN和NF-κB的活性[139,210]。然而,在另一项研究中,SARS-CoV PLpro结构域并没有显着否定仙台病毒感染对NFκB依赖性基因表达的诱导[140]。然而,已经表明,SARS-CoV PLpro通过从IκBα去除K48连接的泛素化来抑制NF-κB的活化[211]。HCoV的其他辅助蛋白也已显示出干扰NF-κB信号传导的作用。 SARS-CoV 3a和7a蛋白的表达可显着诱导NF-κB依赖的荧光素酶活性。通过突变启动子上的NF-κB结合位点,可否定SARS-CoV 3a和7a蛋白增强IL8启动子的活性[192]。以前,在NFκB反应性启动子的控制下,表明MERS-CoV ORF4a的表达可抑制仙台病毒诱导的萤火虫荧光素酶活性,但不能抑制ORF4b和ORF5的表达[133]。然而,另一项研究表明,MERS-CoV ORF4b可适度减弱TNFα治疗诱导的NF-κB依赖的荧光素酶活性[212]。8.结论病毒与其宿主之间的关系是一件复杂的事情:来自病毒与宿主的众多因素都与病毒感染和相应的发病机理有关。在病毒感染期间,宿主必须通过采取多种防御机制来应对病毒。作为细胞内专性寄生虫,病毒还发展了各种劫持宿主机器的策略。在这篇综述中,我们首先展示了病毒因子如何操纵宿主细胞以加速其自身的复制周期和发病机理。我们还着重指出了多种细胞和病毒因素如何在长期的相互抗争中发挥作用。多年来,HCoV已被确定为影响人类的轻度呼吸道病原体。然而,正是SARS-CoV的出现使这些人类病毒成为研究领域的焦点。因此,当今大多数HCoV研究都与SARS-CoV有关。虽然最近的MERS-CoV暴发主要限于中东地区,但从过去两次暴发中的高死亡率可以看出,更多的新兴或重新出现的HCoV可能会威胁到全球公共卫生: SARS冠状病毒(10%)和MERS冠状病毒(35%)。因此,对所有HCoV的发病机理的研究将为抗病毒治疗剂和疫苗的开发获得更多见识。致谢:这项研究得到了新加坡国家研究基金会的竞争研究计划(CRP)资助(NRF-CRP8-2011-05)的部分支持,南阳的学术研究基金(AcRF)一级资助(RGT17 / 13)新加坡科技大学和教育部,以及新加坡教育部的AcRF Tier 2资助(ACR47 / 14)。作者贡献:Yvonne Xinyi Lim和Nyan Ling Ng撰写了这篇论文; James Tam。Tam和Liu Ding Xiang修改了手稿。参考文献(展示部分)1. 佩内(F.) 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2021-01-22 17:00:50
人类冠状病毒:病毒与宿主相互作用的综述(上)
人类冠状病毒:病毒与宿主相互作用的综述Yvonne X in一l IM, y按L ing ng, James P. ta们and ding X Ian GL IU *南洋理工大学生物科学学院,南洋大道60号,新加坡637551;新加坡; YVON0016@e.ntu.edu.sg(Y.X.L.); S150004@e.ntu.edu.sg(Y.L.N.); JPTAM@ntu.edu.sg(J.P.T.)收到:2016年6月8日;接受:2016年7月18日;发布时间:2016年7月25日摘要:人类冠状病毒(HCoV)是已知的与一系列呼吸结果相关的呼吸道病原体。在过去的14年中,重度急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的发作使HCoV在人类中具有很高的致病性,已成为研究界的关注焦点。HCoV-宿主相互作用的研究为我们对HCoV发病机理的理解做出了广泛贡献。在这篇综述中,我们讨论了宿主细胞因子的最新发现,这些因子可能被HCoV利用以促进其自身的复制周期。我们还讨论了各种细胞过程,例如细胞凋亡,先天免疫,内质网应激反应,有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)途径和可能由HCoV调节的核因子κB(NF-κB)途径。 关键词:人冠状病毒;病毒与宿主的相互作用;细胞凋亡先天免疫;内质网应激MAPK;核因子κB 1. 介绍人冠状病毒(HCoV)代表与严重性不同的多种呼吸系统疾病相关的主要冠状病毒(CoV),包括普通感冒,肺炎和支气管炎[1]。如今,由于HCoV具有高的基因组核苷酸取代率和重组能力,因此被公认为发展最快的病毒之一[2]。近年来,HCoV的进化也受到诸如城市化和家禽养殖等因素的推动。这些已允许物种的频繁混合,并促进了这些病毒的物种屏障和基因组重组的穿越[3]。迄今为止,已鉴定出六种已知的HCoV,即HCoV-229E,HCoV-NL63,HCoV-OC43,HCoV-HKU1,严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV);其中,四种HCoV(HCoV-229E,HCoV-NL63,HCoV-OC43和HCoV-HKU1)在全球范围内流通,约占人类普通感冒感染的三分之一[4]。在严重的情况下,这四种HCoV可以引起危及生命的肺炎和细支气管炎,特别是在老年人,儿童和免疫功能低下的患者中[1,5,6]。除呼吸系统疾病外,它们还可能引起肠道和神经系统疾病[7-11]。SARS-CoV最初于2002-2003年在中国广东出现,是一种典型的非典型肺炎,其特征是发烧,头痛以及随后出现的咳嗽和肺炎等呼吸道症状,后来可能发展为危及生命的呼吸衰竭和急性呼吸窘迫综合征[ 12]。它在人类中具有很高的传播性,并迅速传播到29个国家/地区,感染了8000多人,死亡率约为10%[13,14]。最初,棕榈果被认为是病毒的天然贮藏库[15]。但是,随后的系统发育研究指出,SARS-CoV的蝙蝠起源是基于蝙蝠中发现的SARS样病毒序列[16]。 2012年,沙特阿拉伯出现了MERS-CoV流行病,其临床症状与SARS-CoV类似,但是死亡率要高得多,约为35%[17]。与表现出超级传播事件的SARS-CoV不同,MERS-CoV的传播受地域限制[12]。实际上,报告的MERS-CoV病例通常源于中东国家内的暴发或近期到该地区的旅行[18,19]。分类学,基因组结构和形态CoV是冠状病毒科下的一组大型包膜RNA病毒。冠状病毒科与Artierivirdae和Roniviridae一起归类于Nidovirale顺序[20]。根据国际病毒分类学委员会的建议,基于整个病毒基因组的序列比较,冠状病毒进一步分为四个主要属,α-,β-,γ-和三角冠状病毒[21,22]。这些冠状病毒可感染多种宿主,包括禽,猪和人类。已鉴定出HCoV属于Alpha或Beta冠状病毒属,包括Alphacoronaviruses,HCoV-229E和HCoV-NL63以及Betacoronaviruses,HCoV-HKU1,SARS-CoV,MERS-CoV和HCoV-OC43(表1)。在电子显微镜下,冠状病毒病毒颗粒看起来大致呈球形或中等多形性,由刺突蛋白(S)形成独特的“棍状”突起[23,24]。在病毒体内部有一个螺旋对称的核衣壳,它包裹着一个巨大的单链和正向RNA病毒基因组,其大小约为26至32千个碱基[20]。正性病毒基因组RNA充当信使RNA(mRNA),包括51个末端帽结构和31个poly A尾巴。这种基因组RNA在病毒生命周期中具有三种功能:(1)作为感染周期的初始RNA; (2)作为复制和转录的模板; (3)作为包装入子代病毒的底物。复制酶-转录酶是唯一从基因组翻译的蛋白质,而所有下游开放阅读框的病毒产物均来自亚基因组mRNA。在所有冠状病毒中,复制酶基因约占基因组的51分之三,由两个重叠的开放阅读框(ORF),ORF1a和ORF1b组成,它们编码16个非结构蛋白。 CoV基因组RNA的最后三分之一编码四个结构蛋白基因的CoV规范集,顺序为尖峰(S),包膜(E),膜(M)和核衣壳(N)。此外,还沿着结构蛋白基因散布了一些辅助ORF。CoV物种的数量和位置各不相同[25](图1)。图1.人类冠状病毒(HCoV)的基因组组织。 HCoV基因组的大小范围约为26至32千个碱基(kb),如刻度上方的黑线所示。冠状病毒(CoV)基因组通常按51-ORF1a-ORF1b-S-E-M-N-31的顺序排列。重叠的开放阅读框(ORF)ORF1a和ORF1b占冠状病毒基因组的三分之二,该基因组编码了病毒RNA合成所需的所有病毒成分。基因组31末端的另外三分之一编码一组结构蛋白(橙色)和非结构蛋白(绿色)。表1.人冠状病毒的分类。冠状病毒科 菌株发现细胞受体主办参考文献冠状病毒HCoV-229E 1966人氨基肽酶N(CD13)蝙蝠[1,2,21]肝炎病毒-NL632004ACE2棕榈果,蝙蝠[3,21]冠状病毒OC4319679-O-乙酰化唾液酸牛[4,5]β冠状病毒HcoV-HKU1 20059-O-乙酰化唾液酸老鼠[6,7]SARS冠状病毒2003ACE2棕榈果,蝙蝠[8,19,21]冠状病毒2012DPP4蝙蝠,骆驼[9] 2. 宿主因素参与病毒复制和发病机理作为细胞内专性寄生虫,HCoV利用宿主细胞机制进行自身复制和传播。由于病毒与宿主之间的相互作用是疾病的基础,因此有关其相互作用的知识引起了极大的研究兴趣。在这里,我们描述了细胞在冠状病毒感染周期中的作用的已知情况:附着;进入宿主细胞;复制酶-转录酶的翻译;基因组复制和mRNA转录;新包装的病毒体的组装和萌芽(图2)。图2.冠状病毒复制周期。冠状病毒感染始于刺突蛋白(S)的S1结构域与其同源受体的附着。这驱动了S中S2亚基的构象变化,促进了病毒和细胞质膜的融合。核衣壳释放到细胞质后,病毒gRNA通过核糖体移码翻译产生多蛋白pp1a和pp1ab。 pp1a和pp1ab由宿主和病毒蛋白酶进行蛋白水解处理,生成16个非结构蛋白(NSP),然后将其组装形成复制酶-聚合酶。复制酶-聚合酶参与冠状病毒的复制,在该过程中基因组RNA被复制,亚基因组RNA被转录并翻译以形成结构蛋白。产生的病毒产物将在ERGIC中组装,并以光滑壁囊泡的形式发芽到质膜,通过胞吐作用排出。促进感染和抑制感染的宿主因子分别以绿色和红色突出显示。 APN,氨肽酶N; ACE2,血管紧张素转化酶2; DPP4,二肽基肽酶4; 9-O-Ac唾液酸,9-O-乙酰化唾液酸; IFITM,干扰素诱导的跨膜蛋白; ATP1A1,ATPase,Na + / K +转运,α1多肽; HnRNP A1,异核核糖核蛋白A1; MADP1,锌指CCHC型和RNA结合基序1; DDX1,ATP依赖性RNA解旋酶; PCBP1 / 2,Poly r(C)结合蛋白1/2;PABP,Poly A结合蛋白;COPB2,Coatomer蛋白复合物,β2亚基(β素); GAPDH,甘油醛3-磷酸脱氢酶; ERGIC,内质网高尔基体中间隔间;ER,内质网;VCP,含缬氨酸的蛋白。 2.1. 冠状病毒附着和进入CoV感染是通过刺突(S)蛋白附着于特定宿主细胞受体而引发的。宿主受体是病毒的致病性,组织嗜性和宿主范围的主要决定因素。 S蛋白包含两个结构域:S1和S2。 S1结构域及其同源受体之间的相互作用触发S蛋白的构象变化,然后通过S2结构域促进病毒和细胞膜之间的膜融合。今天,所有HCoV使用的主要宿主细胞受体是已知的:HCoV-229E产生的氨肽酶N[26],SARS-CoV产生的血管紧张素转换酶2(ACE2)[27]和HCoV-NL63[28,29],二肽MERS-CoV的肽酶4(DPP4)[30]和HCoV-OC43和HCoV-HKU1的9-O-乙酰化唾液酸[31,32]。除了常规的内体进入途径外,某些冠状病毒也可能进入通过非内体途径,或两者结合的细胞。细胞环境中的低pH值和内体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶可能有助于促进膜融合和内体CoV细胞进入[33]。最近的证据支持组织蛋白酶L在SARS-CoV和MERS-CoV进入中的作用[34-36]。其他宿主蛋白酶,例如跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)和气道胰蛋白酶样蛋白酶TMPRSS11D,也可以在HCoV-229E和SARS期间进行S1 /S2裂解以激活S蛋白,使非蛋白体病毒进入细胞质膜。 -CoV感染[37,38]。此外,MERS-CoV也被弗林蛋白酶激活,弗林蛋白酶是一种丝氨酸内肽酶,已与其他RNA病毒的细胞进入和病毒流出过程中的S1/ S2裂解有关[39]。许多宿主细胞还利用其自身的因素来限制病毒的进入。利用细胞培养系统和假型病毒,许多研究小组确定了干扰素诱导型跨膜蛋白(IFITM)家族,它们可以抑制全局循环的HCoV-229E和HCoV-NL63 S蛋白介导的进入,以及高致病性的SARS-CoV和MERS -CoV [12,40]。尽管IFITM的作用方式仍然难以捉摸,但一些研究小组进行的细胞间融合试验表明,IFITM3通过调节宿主膜的流动性来防止病毒包膜与质膜或内体膜融合,从而阻止了包膜病毒的进入[ 41]。2.2. 冠状病毒复制在病毒核衣壳释放并脱去细胞质后,CoV复制开始于将ORF 1a和1b翻译成多蛋白pp1a(4382个氨基酸)和pp1ab(7073个氨基酸)。在这里,下游的ORF1b通过核糖体移码机制进行翻译,在这种机制中,翻译的核糖体沿´1方向从ORF1a阅读框转移到ORF1b阅读框。通过两个RNA元件(51-UUUAAAC-31七核苷酸滑序列和RNA假结结构)可以实现重新定位。随后,将多蛋白pp1a和pp1ab切割成至少15 nsp,它们组装并形成复制转录复合体。通过复制酶聚合酶的组装,转录基因组RNA的全长正链,形成全长负链模板,用于合成新的基因组RNA和重叠的亚基因组负链模板。然后将这些亚基因组mRNA转录并翻译以产生结构蛋白和辅助蛋白。已经发现几个异源核糖核蛋白(hnRNA)家族成员(hnRNPA1,PTB,SYN-CRYP)对于有效的RNA复制是必不可少的[42]。还建议其他RNA结合蛋白在冠状病毒复制中发挥作用,例如间-α固醇酶和聚A结合蛋白(PABP),DDX1,PCBP1 / 2和锌指CCHC型和RNA结合基序1 (MADP1)[43-45]。2.3. 冠状病毒组装和出口随着新基因组RNA和结构组分的积累,病毒体的组装很快得以实现。在感染周期的这个阶段,含有基因组RNA的螺旋核衣壳与其他病毒结构蛋白(S,E和M蛋白)相互作用形成组装的病毒体。 CoV颗粒的组装是通过从内质网到高尔基体的分泌途径中早期的膜状螺旋核衣壳出芽而完成的。中间隔层(ERGIC)。很少探讨宿主在感染周期此阶段的贡献。目前,已知M蛋白通过在组装位点选择和组织病毒包膜成分并介导与核衣壳的相互作用来使病毒粒子出芽来协调整个组装过程[46]。M蛋白与不同的病毒结构蛋白(例如E蛋白)相互作用,组装成成熟病毒。这种相互作用产生了病毒粒子包膜的支架,并诱导了M蛋白修饰的膜以及与S蛋白的萌芽和释放,从而将刺突组装到病毒包膜中[46,47]。组装和出芽后,病毒粒子在囊泡中运输,并最终通过胞吐作用释放。在最近的一项研究中,抑制含缬氨酸的蛋白质(VCP / p97)导致病毒在感染性支气管炎病毒(IBV)的早期内体中蓄积,表明VCP在负载病毒的内体成熟中发挥了作用[48]。3. 人冠状病毒感染和凋亡凋亡是程序性细胞死亡的过程,其受到严格调节和消炎。当细胞发生凋亡时,它们表现出特定的标志,例如细胞萎缩,广泛的质膜起泡,核变性,DNA断裂和质膜的不对称分布[49-51]。迄今为止,已经建立了两种主要的细胞凋亡机制-外在途径和内在途径。外在途径是通过细胞外死亡配体(例如Fas配体(FasL)和TNF受体相关的凋亡诱导配体(TRAIL))与来自肿瘤坏死因子(TNF)超家族的死亡受体的结合而启动的[52] ]。然后,这些死亡受体募集各种死亡衔接蛋白,例如Fas相关的死亡结构域蛋白(FADD)[53],以及启动子蛋白酶8和10形成诱导死亡的信号复合物(DISC)[54,55]。因此,两个启动子原蛋白酶被切割成其活性形式并诱导信号传导级联,最终激活效应子胱天蛋白酶3和7。另一方面,内在途径在细胞内部发生,并涉及线粒体外膜通透性(MOMP)的变化。 )基于促凋亡和抗凋亡B细胞淋巴瘤2(Bcl2)家族蛋白质的比率(图3)。增强的MOMP会导致促凋亡因子(例如细胞色素c)的释放,从而激活启动子胱天蛋白酶9。像外在途径一样,内在途径中的启动子胱天蛋白酶9的激活会导致蛋白水解裂解效应子胱天蛋白酶3和7,进而分解许多蛋白酶。凋亡必不可少的关键细胞蛋白[56]。当Bid(一种促凋亡的Bcl2家族蛋白)直接被caspase 8裂解时,甚至在效应子caspase激活之前,两条途径之间的融合也可能发生。在病毒感染期间,凋亡被诱导为宿主抗病毒反应之一,以限制病毒复制和生产。许多病毒已经进化出不同的策略来破坏细胞凋亡[58]。例如,某些病毒编码充当Bcl2家族蛋白同源物的病毒蛋白[59]。另外,病毒可能会通过其他分子途径,例如有丝分裂原活化蛋白(MAPK)和核因子κB(NF-κB)途径,直接或间接地建立调节Bcl2家族蛋白或半胱天冬酶激活的机制[60-65]。有趣的是,某些病毒可能会参与凋亡机制以进行有效的病毒感染。例如,甲病毒和黄病毒含有富含磷脂酰丝氨酸的病毒膜,以模仿凋亡细胞以促进病毒进入[66]。3.1. 细胞趋向与凋亡由于HCoV是已知可感染源自呼吸道的组织培养物和细胞系的呼吸道病原体,因此这些病毒也可能感染其他组织培养物和细胞系。这些组织和细胞的感染可能会诱导细胞凋亡[67,68]。然而,尽管HCoV在感染期间主要靶向呼吸道,但它们还与多种细胞类型的凋亡诱导相关,包括肠道粘膜细胞,肾小管细胞和神经元细胞[69-74]。对SARS-CoV感染组织的尸检研究表明,在肺,脾和甲状腺中诱导了细胞凋亡[75]。还显示出HCoV会感染免疫系统并诱导免疫细胞(例如巨噬细胞,单核细胞,T淋巴细胞和树突状细胞)凋亡[69,76-79]。因为这些免疫细胞与先天性和获得性免疫的激活有关,有理由推测,大量消除这些细胞可能是抑制宿主先天性和适应性免疫反应的一种病毒策略。在最近的研究中,据报道HCoV-229E感染导致大量CPE和树突状细胞死亡[80]。由于树突状细胞遍布我们的整个身体,因此有可能将它们用作促进病毒传播和损害我们的免疫系统的媒介[80,81]。 图3. Bcl2蛋白家族对MOMP的调节。 (a)Bcl2蛋白质家族根据其功能和Bcl2同源性(BH)结构域的数量分为三大类。生存前的Bcl2样家族成员(Bcl2,B细胞超大淋巴瘤(Bcl-XL),骨髓细胞白血病(Mcl1))包含所有四个BH结构域,并且具有抗凋亡作用。第二类称为Bcl2相关X(BAX)样蛋白,包括BAX和Bcl2同源拮抗剂杀手(BAK),具有促凋亡作用,并且缺少BH4结构域。最后,第三类称为仅BH3蛋白(Bid,与Bcl2相关的死亡启动子(Bad)和p53上调的细胞凋亡调节剂(PUMA)),仅包含BH3结构域,并且具有促凋亡作用。 (b)提出了两种模型来解释Bcl2家族蛋白在MOMP中的作用-间接激活剂模型和直接激活剂-抑制剂模型[11]。在间接激活剂模型中,抗凋亡的Bcl2样蛋白抑制Bax-Bak孔复合物插入线粒体,从而促进MOMP和细胞色素c的释放。但是,当仅BH3的蛋白被激活超过某个阈值时,Bcl2样蛋白的抑制作用就会被破坏。在直接激活物-抑制剂模型中,仅BH3蛋白充当直接激活物,以诱导Bak-Bak插入线粒体外膜。这些仅BH3的蛋白质可以被类Bcl2的蛋白质抑制,而后者又可以被另一类仅BH3的蛋白质抑制。该图是对[12]的修改。3.2. 细胞凋亡的分子机制在分子水平上,据报道,HCoV感染可通过多种机制触发细胞凋亡。SARS-CoV诱导的凋亡显示为caspase依赖性的,并可能被caspase抑制剂Z-VAD-FMK或Bcl2的过表达抑制[82,83]。尽管病毒复制是诱导细胞凋亡所必需的[83],但细胞凋亡并不影响SARS-CoV的病毒复制动力学[82]。另一方面,MERS-CoV感染原代T淋巴细胞可诱导DNA片段化并激活caspase8和9激活,表明外部和内部途径均被激活。与SARS-CoV感染不同,MERS-CoV复制对于诱导受感染的T淋巴细胞凋亡不是必需的[79]。病原性较低的细胞也可以诱导细胞凋亡芯片数据证实,HCoVs菌株在HCoV-229E感染期间Bcl2家族成员的促凋亡和抗凋亡基因表达发生了显着变化[84]。 HCoV-OC43的感染可促进人神经元细胞中BAX易位至线粒体[74]。尽管胱天蛋白酶3和9在感染HCoV-OC43的鼠和人神经元细胞中被激活[9,74],但添加泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK和半胱天冬酶9抑制剂Z-LEHD-FMK不会影响这些感染的神经元细胞的活力,表明由HCoV-OC43诱导的程序性细胞死亡可能与胱天蛋白酶无关[74]。这突出了在HCoV感染中诱导非经典程序性细胞死亡机制的可能性。尽管在SARS-CoV中仅对此进行了研究,但HCoV感染过程中的凋亡机制很可能受病毒蛋白操纵(图4)。特别是,SARS-CoV S,N,E,M,ORF-6、7a和9b蛋白已显示在其宿主细胞中具有促凋亡功能[77,85-91]。 SARS-CoV E蛋白和7a蛋白的表达通过将抗凋亡的Bcl-XL蛋白螯合到内质网(ER)膜而促进了线粒体介导的细胞凋亡[77,92]。 SARS-CoV M蛋白也高度促凋亡,并介导半胱天冬酶8和9的激活[90]。此外,已显示HCoV-OC43野生型S蛋白在人神经元NT2-N和LA-N-5细胞系中诱导未折叠的蛋白应答(UPR),这可能导致细胞凋亡[93]。重组HCoV-OC43在其S蛋白处具有点突变,比野生型病毒诱导的caspase 3活化和核碎裂作用更强[93]。有趣的是,SARS-CoV N和9b蛋白的定位与caspase依赖性细胞凋亡的诱导有关[89,94]。这一发现为病毒蛋白的亚细胞定位和胱天蛋白酶激活之间的联系开辟了新的视角,而胱天蛋白酶激活是由HCoV调节细胞凋亡的一种方式。图4. HCoVs激活细胞凋亡。死亡配体与死亡受体的结合诱导胱天蛋白酶8激活,继而激活效应子胱天蛋白酶3和7以刺激细胞凋亡。另一方面,内在途径受促凋亡和抗凋亡的Bcl2家族蛋白(如Bcl-XL,Bcl2,Bax和Bak)调控,以诱导MOMP。随后由增强型MOMP引起的caspase 9激活刺激了caspase 3和7激活。在HCoV感染过程中,病毒或特定病毒蛋白(橙黄色方框)靶向外部和固有凋亡信号通路的多个阶段。4. 人冠状病毒感染和先天免疫当细胞暴露于病原体(如病毒)时,免疫应答以宿主防御的形式被诱导。在病原体暴露期间,以细胞类型依赖性方式调节免疫应答。在产生适应性免疫系统之前,先天免疫是抵御病毒的第一道防线。宿主和病毒都可以操纵先天免疫机制作为防御或逃避策略的一种形式[95,96]。 4.1. 模式识别受体免疫系统中的细胞通过几种识别策略来检测病毒病原体。其中,特征最清楚的是模式识别受体(PRR),其通过称为病原体相关分子模式(PAMPs)的进化保守结构与各种微生物病原体结合。 PRR主要分为三类,即Toll样受体(TLR),视黄酸诱导型基因I(RIG-1)样受体(RLR)和核苷酸寡聚化域(NOD)样受体(NLR)。TLR是一种I型跨膜蛋白,位于细胞表面或内体囊泡中。它们的富含亮氨酸的重复序列(LRR)域介导了对PAMP的识别以及来自细菌,真菌和病毒等各种来源的损伤相关分子模式(DAMP)[97]。 TLR的激活主要发生在抗原呈递细胞中,例如树突状细胞(DC),巨噬细胞,单核细胞和B细胞。在人类的10种已知TLR中,发现TLR2、3、4、7和9与病毒检测有关[98,99]。 TLR3识别双链RNA(dsRNA),这是病毒RNA复制过程中产生的复制中间体[100]。TLR7和8检测单链RNA(ssRNA),TLR9识别DNA病毒中存在的未甲基化CpG DNA [101-103]。除核酸外,其他TLR(例如TLR2和4)还可以检测到病毒蛋白,例如呼吸道合胞病毒(RSV),肝炎病毒,麻疹病毒和人类免疫缺陷病毒[104-107]。识别病毒成分后,TLR募集含有Toll /白介素1受体(TIR)的信号转接头分子,例如MyD88(髓样分化主要反应蛋白88)和含有TIR域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)[108–110]。然后,MyD88和TRIF刺激MAPK和NF-κB途径,以增强IFN和促炎性细胞因子的产生[111]。点击:病毒与宿主相互作用的综述(中) 查看更多医学文章 使用双语翻译功能免责声明:福昕翻译只充当翻译功能,此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的,仅代表作者个人观点,与本网站无关,版权归原始网站所有。仅供读者参考,并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等,请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。来源于:mdpi
2021-01-21 17:30:35
人类冠状病毒:病毒与宿主相互作用的综述(中)
人类冠状病毒:病毒与宿主相互作用的综述(上)与TLR不同,RLR和NLR普遍存在。 RLR是一个胞质受体家族,由三个成员组成:视黄酸诱导基因I(RIG-1),黑素瘤分化相关因子5(MDA5)和遗传与生理学实验室2(LGP2)。 RIG-1和MDA5在其N端具有两个胱天蛋白酶招募域(CARD),一个DExD / H-box RNA解旋酶域(其中x可以是任何氨基酸)和一个在C端的阻遏域(RD)。另一方面,LGP2缺少CARD域[112],并且它可以调节RIG-I和MDA5。积极或消极[113–115]。 RIG-I识别病毒基因组中存在的51-三磷酸部分RNA,以及通过病毒基因组互补末端的自退火形成的双链“panhandle”结构[116,117]。相反,MDA5通常会检测到更长的dsRNA序列。 RIG-1和MDA5与病毒RNA的结合会导致构象变化,从而暴露CARD域。募集了一种定位于线粒体和过氧化物酶体的衔接子蛋白,称为线粒体抗病毒信号转导适配器,MAVS。然后,MAVS激活转录因子,例如干扰素调节因子1(IRF1),IRF3和NF-κB,以触发干扰素(IFN)和促炎性细胞因子
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切口深度比对钢纤维混凝土开裂后行为的影响(上)
切口深度比对钢纤维混凝土开裂后行为的影响 通过:何塞·瓦尔迪兹·阿吉拉尔,塞萨尔·华雷斯·阿尔瓦拉多 ,何塞·M·门多萨·朗格尔和贝尔纳多·T·泰兰·托雷斯收到:2020年12月13日/修订:2021年1月5日/接受:2021年1月8日/发布:2021年1月18日 摘要:混凝土几乎没有抗拉强度,易开裂,导致使用寿命降低。因此,重要的是找到有助于减轻这些缺点的互补材料。这项研究的目的是通过研究四种缺口深度比0、0.08、0.16,通过分析和实验方法确定添加钢纤维对开裂后阶段纤维增强混凝土性能的影响。和0.33。使用普通混凝土(对照)和体积纤维分别为0.25%和0.50%的纤维增强混凝土,通过72次弯曲测试进行了评估。结果表明,缺口与深度之比最高为0.33的样品能够实现硬化行为。研究结果表明,即使还增加了切口深度比,剂量的增加也会导致残余性能的提高。关键词: 钢纤维增强的混凝土; 钩端钢纤维; 后开裂行为; 切口深度比;延性; 韧性; 断裂能1. 介绍由于其多功能性,可成型性以及其成分的广泛可用性,混凝土是世界上使用最广泛的建筑材料[1-3]。但是,混凝土几乎没有抗拉强度,容易开裂,导致使用寿命降低,因为一旦开裂开始,混凝土就缺乏机械强度,突然失效[4-8]。因此,材料科学和混凝土技术一直在努力寻找一种可以减轻这些缺点的补充材料,一旦达到初次裂纹负荷,就可以提供防止完全断裂的能力。换句话说,他们正在努力寻找一种有助于改善应变容量和能量吸收的材料。这些材料之一是钢纤维。几项有关钢纤维的研究证明,混凝土的抗压强度仅有最小的提高[9-13]。但是,在抗拉强度测试[14-16]上已对性能产生了很大的影响,而在冲击载荷和残余强度测试上则更显着[17-20]。钢纤维适合于增强混凝土,因为它们提供了能量消散机制,并且比普通混凝土更有效地控制了残余阶段的裂纹扩展。后者是使用这种增强材料的主要优点之一。但是,由于有效的混凝土面积,其他特性也会受到影响,例如,纤维的残余性能,这是应力通过纤维与水泥基体之间形成的键传递的主要因素之一[21]。 残余性能的研究可以通过带有受控裂纹的缺口试样来进行,从中获得代表性数据,并且其分散系数小于未缺口试样的分散系数[22,23]。据报道,使用钢纤维增强混凝土(SFRC)有几个优势,例如,降低成本和改善结构质量,主要是在裂缝控制和循环荷载下[24]。一些作者集中研究了埋入普通混凝土和钢纤维增强混凝土纽带中的钢筋的拉伸刚度效应,改变了主要参数,例如纤维体积,最大骨料尺寸和钢筋直径,观察钢纤维混凝土在控制钢筋混凝土结构裂缝模式中的有效性[25]。另一方面,据报道,随着钢纤维的加入,弯曲裂纹的宽度明显减小,而随着钢纤维的加入,第一裂纹载荷和最大载荷也增加了[26]。其他对其他类型纤维的研究,即聚丙烯纤维(PFRC),发现断裂能较高,这是因为PFRC裂解后性能与纤维分布和取向之间有很强的依赖性[27]。关于表征纤维增强混凝土的弯曲试验,发现试样的破坏模式受其跨深比的影响。这意味着它的失效模式是由剪切或弯曲控制的[28]。对于残余强度评估,国际规范和标准已建议对中跨槽口的梁试样进行三点弯曲试验,以通过将槽口深度比(即a /d)确定为0.16 [20]来控制裂纹的发展。 ]。在这项研究中,通过添加两种剂量的钢纤维,一种20 kg / m3(0.25%)(系列1),另一种40倍的钢纤维,研究了缺口深度比对纤维增强混凝土的影响。 kg / m3(0.50%)(系列2),在150毫米×150毫米×600毫米的棱柱形试样上经受弯曲张力(即三点弯曲试验)的试样中。通过在试样的[15,17,18,29]中形成13、25和50 mm的缺口,可以控制裂纹的产生,从而使缺口与深度的比率(a /d)为0.08、0.16,和0.33。本文研究的目的是通过计算特征残余应力来研究对钢纤维残余性能的影响,混凝土面积的减少以及对残余强度的分类,从而确定钢纤维的强度。裂纹的扩大和向缩小的混凝土区域的传播。本研究的新颖之处在于确定缺口深度比(a / d)小于0.16的纤维增强混凝土的残余性能。这与文献中的其他研究不同,后者考虑了更大的陷波深度比。考虑较低的比率可以研究断裂后的行为以及在断裂过程区域中比标准更大的断裂能量。2.理论方面为了理解(a / d)比的影响,有必要提及混凝土中非线性断裂力学的一些概念。一般而言,断裂力学被定义为具有很大实用性的失效理论,因为它利用了高能准则,该准则与强度准则一起考虑了裂纹在结构中的传播[30]。但是,尽管有其实用性,但已发现,混凝土的性能并不能通过线性弹性断裂力学(LEFM)来定义,因为混凝土会形成较大的断裂加工区(FPZ),可承受由于软化而引起的渐进破坏由微裂纹引起的。这导致裂纹尖端释放的能量流减少;同时,裂纹的组合表面积增加,从而提高了断裂过程区(FPZ)的能量吸收能力,因此,要了解混凝土的性能,必须详细阐述非线性断裂力学[ 30]。非线性断裂力学是更好地描述混凝土行为的理论之一。非线性断裂力学是对固体裂纹的研究,该裂纹在自然界中表现出非线性的本构响应,这与考虑了几何和材料线性的LEFM相反[31]。根据所施加的载荷,建筑材料可以表现出几种行为。一些材料几乎没有表现出变形能力或没有变形能力,因此被认为是易碎材料。相反,存在被认为是延性的材料。混凝土是一种特殊情况,因为其行为不能完全表征为易碎品,因为它更可能被描述为准易碎材料。在出现第一个裂纹(应变硬化)后,混凝土显示出拉伸应力的逐渐衰减(应变软化),无论拉伸强度有无改善。因此,总的来说,失败可以不屈服[32,33]出现。要考虑的另一个重要方面是能量吸收的能力,它是通过载荷位移或载荷裂纹打开曲线下的面积获得的。考虑能量吸收是必要的,尤其是在动态载荷下,因为它决定了结构的延展性。在易碎材料中,没有FPZ时,弹性能作为表观能量消散。同时,在易延展材料中,FPZ是可耗散大量能量的塑料区,其能量大于表层能量。对于准易碎材料(例如混凝土),FPZ通常大于易碎材料或易碎材料的区域[34,35],并在破坏前耗散大量能量,从而提供了开裂后的非线性响应(软化) [32]。在确定的体积分数下向混凝土中添加钢纤维可改善延展性并增加FPZ的初始宽度,结果是由于纤维的提取而扩大了区域[36] ]。随机分布的钢纤维在基体开裂后,通过延迟裂纹的形成,限制其生长并减小裂纹尖端的开度位移,显示出最重要的作用,因为纤维通过一种方法抑制了裂纹。提取过程中的桥联机制[37,38]。以同样的方式,钢纤维的使用大大提高了能量吸收和延展性[39]。值得一提的是,混凝土的脆性行为与其抗压强度的增加成正比,而添加钢纤维有助于消除这种脆性,从而导致生产出具有改善的拉伸强度,延展性和抗拉强度的材料。韧性[40,41]。与普通混凝土相比,这种材料显示出延伸的软化分支,其特征在于显着的拉伸残余强度和更高的断裂能[9],后者是衡量准易碎材料断裂过程的主要成分。3.材料和方法为了进行这项研究,共生产了4种普通混凝土混合物,每种所使用的缺口与深度之比为一种。此外,还生产了8种纤维增强混凝土的混合物(每种纤维百分比为4)。使用水泥OPC 40满足NMX-C-414-ONNCCE-2014 [42]的要求生产混合物;标准粉碎的石灰石骨料,最大尺寸为19 mm(3 / 4jj),细度模量为2.42;水;以及聚羧酸类减水剂作为添加剂。使用的钢纤维是“钩端”纤维,长度(lf)为50毫米,直径(df)为1毫米,长径比(lf / df)为50,拉伸强度为1130 MPa;纤维体积分别为0.25%和0.50%,这是根据标准EN 14845-1,2007 [43]推荐的获得残余强度的体积。该标准还规定最大水泥含量为350 kg / m3,水灰比为0.55。表1列出了每种混合物的组成。表1.混合物组成。材料1号2号S-3孜然(kg / w)350350350添加剂(毫升/千克)1.91.91.9碎石(M.S. 19毫米)(kg / m3)810810810沙(kg / m3)102710201014水(kg / m3)193193193纤维(kg / m3)02040空气含量(%)1.82.52.8坍落度(毫米)130115105网络时间6793.1.断裂试验方法 使用了三种不同的混合物,以及四种不同的切口深度(即0、13、25和50 mm)。需要第一混合物作为参考系列(即,体积纤维,Vf = 0%)。用这种混合物制成每个深度为150 mm×150 mm×600 mm的6根光束。因此,总共构造了24个标本。在第二和第三混合物中,分别使用了0.25%和0.50%的纤维体积(Vf)。因此,对于每种混合物和每种切口深度,总共也要制造24个样品。因此,总共48个棱柱形试样由纤维制成,具有上述尺寸和切口深度。通过对72个样品(普通混凝土和纤维增强混凝土)进行了开槽弯曲挠曲试验,评估了添加钢纤维对开裂后性能的影响,并对其进行了描述。相应的陷波深度比(a / d)分别为0、0.08、0.16和0.33。值得一提的是,开槽步骤是根据标准EN 14651-2005进行的,其中常见的开槽深度为25 mm [20]。在该实验程序中,使用了裂口张开位移法(CMOD)相对于施加的载荷作图。开口的测量采用夹式引伸计进行,标距长度为20 mm,行程为+12 mm / –2 mm(见图1a和2a),目的是估计通过防止诱发裂纹的扩大,具有通过样品的裂纹面传递纤维应力的能力。此外,将线性范围为12.7 mm的线性可变差动变压器(LVDT)放置在试样的中跨处,以测量由于施加的载荷引起的位移,并确定钢纤维对钢的韧性和延展性的贡献。复合材料(见图1b和2b)。 (a) (b)图1.棱柱形试样的拉伸弯曲试验。 (a)通过引伸计夹式Epsilon品牌测量裂纹口的开口。 (b)通过VISHAY品牌的线性可变差动变压器(LVDT)测量样品中跨的挠度。图2.三点弯曲测试的配置,尺寸以mm为单位。 (a)裂纹口的测量。 (b)用LVDT测量中跨位移。3.2.负载和应力处于比例极限实验结果从所述负载在比例极限或从负载为初裂(FL),其为负载的记录到为0.05mm并[a CMOD较大值而获得9,36 ]。借助于等式(1)[ 20 ]计算出在出现第一裂纹时相应的作用应力。其中f L =比例极限处的应力(N / mm 2),F L =比例极限处的载荷(N),L =试样的跨度(mm),b =试样的宽度(mm),hsp =试样顶面与引起裂纹的尖端之间的距离(毫米)。3.3.正态和特征残余应力在剩余阶段,钢纤维的贡献至关重要。在裂后阶段,该贡献是通过法向应力(f Rj),所测CMOD的每个特定值获得的,并由等式(2)计算[ 20 ]。其中f R,j =在点j处的法向残余应力(N / mm 2),f Rk,j =在点j处的特征残余应力(N / mm 2),F R =给定裂纹口开口的载荷位移测量。f R,1,f R,2,f R,3和f R,4的值是0.5、1.5、2.5和3.5 mm裂纹嘴开口的法向残余应力(N / mm 2) , 分别。以类似的方式,f Rk,1,f Rk,2,f Rk,3和f Rk,4的值是0.5、1.5、2.5和3.5 mm的特征残余应力(N / mm 2)。分别开口。在这项研究中,特征残余强度的评估是根据CEB-FIP模型代码2010 [ 44 ]中建立的程序,通过方程式(3),以及在Molins和Arnau 2012中获得的因子进行的;RILEM TC-162,2003,在所列出的表2 [ 45,46 ]。 其中,n =测试样本的数量,k xN =当总体集合的变异系数已知时的统计因子,k xn =当总体集合的变异系数未知时的统计因子。 表2. 系数k x与被测样品数量的关系。n123456810κξγ2.312.011.891.831.81.771.741.72κξγ3.372.632.332.1821.92 3.4.断裂能纤维增强混凝土试件的断裂能估算采用了两种模型,它们各自的参数和原理互不相同。对于模型1,Barros等人提出。[ 47 ]如式(4)所示,需要诸如样品质量和最终位移的测量参数。另一方面,对于第二个模型,需要使用图[ 48 ]。Kazemi等人提出的模型2。[ 48 ]由等式(5)表示,并假设将试样断裂所需的功与破裂表面成正比:其中GF=总断裂能(N/ m); Wf=曲线载荷下的面积与裂缝开度(或位移)的关系,是由于断裂引起的功(N-m)或(J);m =样品质量(kg); a =样品的总长度(l)与跨度(支撑之间的长度)(L)之间的关系; a0 =初始切口深度(m); b =样品宽度(毫米); d =光束深度(米); g =重力加速度常数(9.8 m/ s2);Su=测得的位移或裂纹开口的最大值(m); S =装置的标准偏差(N /mm2);L =试样长度(毫米); r =试样顶面与裂纹尖端之间的距离(m)。4.结果与讨论4.1.比例极限行为图3显示了三个系列中每个系列在比例极限下的负载获得的结果。可以观察到,随着切口深度比(a/ d)的增加,负载能力降低,其中对于比率(a/ d)分别降低了33%,53%和66%分别为0.08、0.16和0.33。因此,随着切口-深度比的增加,混凝土变得易于破裂失败。这种现象是由于断裂加工区(FPZ)的减少,也称为韧带长度,它在开裂过程中允许更高的能量耗散[48]。 Zihai Shi [49]也认识到了这种负荷的减少,其中韧带长度的减少导致峰值负荷的减少。图3. 比例极限下的实验行为。以相同的方式,在图3中,还可以观察到,负载阻力主要取决于混凝土的阻力面积,而不取决于所添加的纤维量。这可以通过观察在不同纤维体积Vf下每个比率(a / d)所获得的相似载荷值来识别,这表明,对于第一个裂纹发展之前的阶段,纤维几乎或根本没有影响复合材料的强度。从该行为,获得了一般图形(参见图4),其行为也可以用公式(6)描述。 图4. 比例极限下的一般行为。表3列出了每个研究系列的第一个裂纹出现所需的应力。在该表中,计算的应力趋于随着切口深度的增加而减小。另外,对于那些没有初始刻痕的试样,与具有初始刻痕的试样相比,要求更高的应力才能使第一个裂纹出现。与最初产生缺口的混凝土面积相比,这种行为与试样中混凝土面积更大。但是,值得注意的是,(a / d)= 0的试样显示出较大的变异系数(CV),这是因为未控制开裂过程,并且在试样的整个长度上裂纹可能出现在不同的区域,导致残余行为的变化。表3. 在比例极限(N / mm 2)处的计算应力。对于系列1和2,获得的结果分散最少,比率(a / d)= 0.16,这是标准EN 14651,2005 [ 20 ]所建议的陷波深度比。与所研究的其余(a / d)比率相比,观察到了裂化过程的控制。此外,比率(a / d)= 0.16时,在后裂化阶段中获得了纤维性能的更代表性的行为。而且,以该比率,深度足够大,以利于在所需区域中出现第一裂纹,并产生足够大的混凝土区域,以使纤维在残余阶段中适当地传递应力。4.2.破解后行为图5-8显示了在弯曲拉伸试验中,钢纤维系列和每种(a / d)比的结果。在这些图中,可以注意到,如前所述,在比例极限(曲线的线性部分)处的负载与所用纤维的数量无关。此外,还可以观察到,纤维的主要作用是在后裂化阶段获得的[13,15,50]。 图5. (a / d)= 0的弯曲拉伸试验曲线:(a)系列1和(b)系列2。 在对应于系列2的图中,与对应于系列1的那些相比,在裂后阶段显示了更大的性能,其残余载荷等于或什至大于在第一裂化过程中获得的平均载荷。发生阶段。由于使用了大量的纤维(即,Vf = 0.50%),这导致硬化行为,这通过增加通过裂纹面传递应力的能力而改善了裂纹后阶段的性能。图6. (a / d)= 0.08的弯曲拉伸试验曲线:(a)系列1和(b)系列2。图7. (a / d)= 0.16的弯曲拉伸试验曲线,(a)系列1,(b)系列2。通过分析这两个获得的曲线的结果,在图5-8中,可以在残余阶段以小于4 mm CMOD的值观察到样品的最大性能,这相当于在3.64 mm处的位移。中跨,之后开裂性能会降低。这是最重要的,因为通常在计算光纤性能时考虑该值,对于中跨度的3.5mmCMOD或3mm挠度,该值是获得的[9]图8.(a / d)= 0.33的弯曲拉伸试验曲线:(a)系列1和(b)系列2。 4.3.正常残余应力在图9中,显示了两个研究系列的法向残余应力(fR,j)的结果。基于所使用的(a / d)比率,可以注意到,从图9a-d中可以看出,比例极限处的载荷值是一致的,与所使用的纤维量无关。这表明纤维在第一次破裂发生之前的阶段几乎没有影响。还值得注意的是,通过增加比率(a / d),通过增加纤维的剂量可以改善所产生的残余性能。例如,比率(a / d)=0的样品的残余性能增加了61%。同时,(a / d)比分别为0.08、0.16和0.33的序列分别增加了157%,129%和86%。以相同的方式,对于0.08至0.16的比率,随着纤维剂量的增加而达到最大性能,而对于0.33,其残余性能降低。4.4.特征残余应力在图10a,b中,显示了系列1和2的每个(a / d)比的特征残余应力(fRk,j)的实验结果,以及每种情况下它们的相应平均应力曲线。可以注意到,特征残余应力对法向残余应力的变化非常敏感。这可以在图10a中得到验证,图10a中的比率(a / d)= 0和0.08显示的残余性能低于从比率(a / d)= 0.16和0.33获得的残余性能。因此,比率(a / d)= 0和0.08不符合标准EN 14845-2,2006 [41]中确定的最低要求。对于系列1,通过增加比值(a / d),可以在开裂后阶段获得更合适的性能,这表明在试样表面上有足够的应力传递。另一方面,在图10b中,通过使用大量的纤维(系列2),特征残余应力满足标准的最低要求[41]。但是,关于系列2的比率(a / d)的行为与在系列1中获得的结果不一致,因为比率(a / d)= 0.08提供了所有所用比率中的最佳残留性能(请参见图10b)。这可能是纤维数量影响的结果,纤维数量可以在较大的混凝土区域中更好地分布。对于两个系列,比率(a / d)= 0均显示最差的性能。(b) (b) (c) (d)图9.纤维系列和每个研究的(a / d)比(a)0,(b)0.08,(c)0.16和(d)0.33的残余法向应力。切口深度比对钢纤维混凝土开裂后行为的影响(下) 点击:查看更多其他分类文章 免费试用文档翻译功能免责声明:福昕翻译只充当翻译功能,此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的,仅代表作者个人观点,与本网站无关,版权归原始网站所有。仅供读者参考,并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等,请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。 来源于:mdpi
2021-01-19 19:00:19
切口深度比对钢纤维混凝土开裂后行为的影响(下)
切口深度比对钢纤维混凝土开裂后行为的影响(上)从实验中获得的接近平均法向应力的特征残余应力的评估要求测试之间的分散度较低。这可以通过增加样本数来实现。这将导致统计不确定性因子kx减小,因此结果的变化将较小。在表4中,示出了两个系列的残余强度的分类。根据模型代码2010(MC-2010)[44,45]的建议,对于分类,分别对五个和六个样本进行了测试,系数kxn = 2.33和2.18。没有分类的(a/d)比是没有达到最小特征残余强度1N /mm2的比。对于系列1的比率(a/ d)= 0和0.08所获得的结果低而不足,不足以达到最小特征残余应力并能够对其残余行为进行分类。相反,比率(a / d)= 0.16和0.33在它们各自的残余响应中显示出完美的塑性行为和硬化行为。图10. 每个(a / d)比的特征残余强度:(a)系列1和(b)系列2。如表4所示,系列2的结果表明,通过增加(a/d)比率,也会在残余阶段提高性能,这可能会导致硬化行为,如表4所示。 (a/ d)= 0.33比率。这证明了纤维含量足够高,可以在弯曲下表现出硬化行为[50]。这表明,即使通过增加比率(a /d)减小到达第一裂纹的峰值载荷,通过改善残余阶段的性能,纤维的添加也可以达到甚至超过这种载荷。该行为将不取决于破裂表面上的总纤维量,而是取决于对水泥基体的破裂过程的控制有有效贡献的纤维量。4.5. 钢纤维混凝土的断裂能如表5所示,系列1的(a / d)比的增加对断裂能产生不利影响,如用断裂功模型1计算的那样。这表明具有纤维的增强基体无能为力。阻止裂纹扩展;这与系列2中观察到的相反,在系列2中,通过使用大量的纤维(即40 kg / m3),即使(a / d)比增加,断裂能也会增加。这种行为意味着,由于存在大量的纤维,通过整个裂纹面的应力的桥接机制,裂纹强度会增加,这会在基体中产生多重裂纹条件。表5. 用模型1 [ 47 ]计算的用纤维增强的样品(系列1和系列2)的断裂能。这样,由于钢的提取过程,裂化后阶段获得的断裂能将受到位于水泥基体中的纤维量以及残余阶段中传递应力的能力的影响。纤维由于其钩状端的拉直而产生较高的能量消耗。通过限制裂纹的扩展以及限制裂纹的发生,它们也具有减小裂纹上部应力集中的能力[36,37,51-57]。如前所述,在比率(a / d)= 0.08和0.33的情况下,考虑到系列2的断裂能的平均增量超过100%,断裂能表示纤维在残余阶段的重要贡献。 ,相对于系列1获得的结果。对于比率(a / d)= 0,相差仅为57%;对于这表明样品中没有缺口将无法使纤维有效发挥作用,从而限制了能量断裂的增加。图11a,b显示了用于斜率裂缝工作模型(模型2)的剩余阶段裂缝能量计算的图表。在这些图中,代表了每组测试样品以及韧带的初始大小(样品顶面和缺口尖端之间的面积)。考虑到断裂功与开裂表面成比例,并且开裂的最终面积等于韧带的初始面积[48]。图11.用斜率断裂功模型2计算断裂能的曲线拟合:(a)系列1和(b)系列2。在这些图中,对于缺口从上到下的裂隙梁,认为零能量的必要性。这意味着假定曲线从原点开始。此外,曲线的斜率表示裂纹扩展一个深度单元所消耗的能量。通过将该斜率除以梁的宽度(b),可以得出所需的断裂能。值得一提的是,通过该模型获得的断裂能结果与第一个模型获得的结果相对接近。这些值在表6中表示,其中GF(1)和GF(2)分别代表从模型1和2计算得到的断裂能。表6.通过研究模型计算的断裂能(GF)[58]。可以看出,第二个模型与结果的变化有直接关系,因为通过获得高变化系数,因子R2也将增加。这可能导致难以获得复合材料的后裂化阶段行为的代表性结果。5.结论本文介绍的结果仅限于具有钢纤维的纤维增强混凝土,并且已描述了体积纤维的百分比。因此,需要使用其他类型的纤维(合成纤维和天然纤维)并具有不同的特性进行实验,以扩大改善混凝土开裂后响应的机会范围。根据结果,可以得出以下结论:1. 假设在每个研究系列中获得的载荷值都是封闭的,则比例极限下的载荷不受钢纤维添加的影响。这表明,在此阶段,材料的性能主要取决于水泥基质和剩余的混凝土面积。2. 荷载和应力在比例极限处表现出与缺口深度比成反比的行为,这种比例的增加将导致混凝土易于失效。3. 纤维剂量的增加导致法向和特征残余应力的改善。4. 对于系列2,切口深度比(a / d)的增加会增强法向和特征残余性能。对于比率(a / d)= 0,法向残余应力的增量为61%,而对于比率(a / d)= 0.08、0.16和0.33,增量为157%,129%和86 %, 分别。比值(a / d)= 0.08提供了所有考虑的比值中最佳的特征残留性能。5. 对于系列1,切口深度为25毫米,等于(a / d)的比值为0.16,是满足国际标准中规定的最小残余应力要求的唯一比率。6. 对于少量的纤维(在这种情况下为20 kg / m 3)和小的(a / d)比(即a / d <0.16),由于残留强度的最小分类是不可能的,这是由于样本无法达到最小值的事实。7. (a / d)= 0.33可以得到更大的残余强度分类,这意味着开裂后的性能不取决于混凝土,而是取决于纤维传递应力的能力。试样的裂纹面以及位于分析区域的纤维数量。8. 通过将纤维体积从20 kg / m 3增加到40 kg / m 3,断裂能增加了约97%(模型1)和约35%(模型2)。这意味着钢纤维有助于改善复合材料的残余性能。9. 对于系列2,即使(a / d)比也增加,断裂能也会增加。大量纤维的存在使抗裂强度增加,并在基质中产生多重裂化条件。10. 所使用的数学模型显示出相似的结果,尤其是对于混凝土中钢纤维含量高的情况。11. 相对于标准中推荐的比率,本研究中获得的结果将为不同比率(a / d)提供实验参考框架,这可以有助于对从实验室测试确定的残余应力进行分析的标准。参考文献1. Selvamani,G。 Duraisamy,S .; Sekar,A。《纤维增强混凝土综述》。诠释J.文明。技术。 2016,7,1–8。2. Orbe,A。 Rojí,E。; Square,J .; Losada,R.优化结构HACFRA(钢纤维增强的自密实混凝土)组成的研究。建筑信息2015,67,e061。3. Vairagade,V.S .;Kene,K.S.使用金属和合成纤维的普通混凝土的强度。 Procedia工程师。 2013,51,132–140。[CrossRef]4. 艾莉·H;安东尼斯冲绳约束钢纤维混凝土梁的试验研究。 Procedia工程师。 2015,125,1030–1035。 [CrossRef]5. Tiberti,G .; Minelli,F.;Plizzari,G.钢纤维在钢筋混凝土构件中的开裂行为:一项综合实验研究。 Cem。确认Res。 2015,68,24–34。 [CrossRef]6. G. A.S.Santhi;加内什(Ganesh)卷曲和钩端的钢纤维对混凝土抗冲击性的影响。J.应用科学。 2014,17,259–266。[CrossRef]7. 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2021-01-20 19:08:54
干细胞疗法治疗肝病
克拉拉·尼古拉斯(ClaraNicolas)1,*,王玉佳(Jiang Wang)1,珍妮弗·吕布·惠勒(Jennifer Luebke-Wheeler)1和斯科特·尼伯格(Scott L.Nyberg)1,2收到:2015年11月25日;接受:2015年12月31日;发布时间:2016年1月6日学术编辑:邓文斌1 William J. von Liebig移植和临床再生中心,梅奥诊所,罗切斯特,MN 55905,美国; wang.yujia@mayo.edu(Y.W.); luebke-wheeler.jennifer@mayo.edu(J.L.-W.); nyberg.scott@mayo.edu(S.L.N.)2 美国罗切斯特市梅奥诊所外科科,美国明尼苏达州55905 摘要:细胞疗法是几种肝脏疾病的新兴治疗形式,但受到供体肝脏可用性的限制。干细胞有望替代原代肝细胞。我们对文献进行了详尽的回顾,重点是涉及使用干细胞治疗肝病的最新研究。干细胞可以从多种来源中收获,或者可以从体细胞中产生以产生诱导性多能干细胞(iPSC)。实验上已经使用了不同的细胞系来支持肝功能,并治疗遗传性代谢异常,急性肝衰竭,肝硬化,肝癌和小型肝移植。基于细胞的疗法可能涉及基因疗法,细胞移植,生物人工肝装置或生物工程器官。该领域的研究仍然非常活跃。将来,干细胞疗法可被用作肝移植或内源性肝再生的桥梁,但是必须开发有效的分化和生产方案,并且必须证明其安全性,然后才能将其应用于临床实践。关键词:干细胞;肝病;诱导多能干细胞;基因校正细胞移植生物人工肝再生医学细胞疗法1. 介绍迄今为止,肝移植是治疗药物难以治疗的多种肝病的唯一有效方法。不幸的是,对供体器官的需求大大超过了其供应,因此有必要替代全器官肝移植进行治疗。针对可移植肝脏的短缺,已经出现了细胞疗法。已经评估了离体肝脏支持疗法和体内细胞移植,并显示了治疗肝衰竭的潜力。肝脏由于其内源性的再生和修复能力强,因此特别适合这种疗法[1-3]。分离的原代肝细胞是体内和离体细胞疗法中要测试的第一类细胞,但是它们的使用受到许多尚待克服的技术难题的限制。肝细胞在体外培养中不能长期存活[4],因为(1)体外生长能力极低[5],(2)肝特异性基因的表达在体外迅速下降[6]和(3)易冻性融化的破坏使冷冻保存变得复杂[7]。然而,使用它们的主要限制是由于供体肝脏的缺乏,无法分离出高质量的原代肝细胞,因此无法满足临床对肝细胞的需求。随着再生医学的到来,肝细胞治疗的重点已经稍微转移到干细胞的治疗潜力上,这是一种在组织损伤后恢复正常结构和功能的手段。干细胞的分化和自我更新能力使其成为无数肝细胞生成的合理来源。因此,干细胞疗法可以替代全器官肝移植在治疗肝脏疾病方面具有广阔的前景。几种类型的干细胞已被证明适用于肝细胞置换。在这篇综述中,我们探讨了每种细胞系的优势和局限性,以及可能从干细胞疗法中受益的各种肝脏疾病。 2. 干细胞来源用于肝病治疗2.1. 肝干细胞干细胞可以从成年或胎儿肝脏获得。成人肝干细胞(也称为卵圆细胞)和胎儿肝干细胞(称为成肝细胞)都是双能的,因此能够分化为肝细胞或胆管细胞[8-10]。已经证明,当肝细胞的复制能力受损时,卵形细胞会在肝再生中发挥作用[11],而在动物模型中,已通过实验将成肝细胞用于肝再生[12,13]。人成肝细胞也已被培养,并已显示出移植到免疫缺陷小鼠体内后在体内的植入和分化[14]。使用肝源性干细胞的主要限制是正常肝中它们的数量非常低,卵圆形细胞仅占成年肝的0.3%至0.7%[15],而成肝细胞仅占成年肝的不到0.1%。胎儿肝脏肿块[16]。这使得它们的隔离和扩展具有挑战性,从而限制了其在小规模使用中的应用。2.2. 骨髓干细胞骨髓干细胞包括造血干细胞和间充质干细胞(MSC)[17]。 MSC是在骨髓和其他成年器官和组织(例如脂肪组织)中发现的多能祖细胞,它们很容易获得,并且可以在培养物中快速扩增[18,19]。在这两个细胞群中,已建议MSC具有更高的肝再生潜力[20]。此外,它们比造血干细胞具有另一个优势:它们具有免疫调节或免疫抑制特性,可下调T细胞,B细胞和NK细胞的功能[21]。在临床上,这可以转化为肝移植后诱导耐受的能力。2.3. 附件干细胞附件干细胞是容易获得的细胞,其衍生自人胎盘组织,脐带和脐带血以及羊水。它们是多能的,因此与成体干细胞相比,它们具有更高的分化潜能,并且具有更高的增殖率[22-24]。附件干细胞还提供了另一个优势:尚未描述它们可在人类中形成畸胎瘤或畸胎瘤。在一项研究中,急性毒性肝损伤后向非肥胖型严重合并免疫缺陷小鼠腹膜内施用人脐带血干细胞显示出快速的肝移植,分化为肝细胞,改善了肝的再生并降低了死亡率[25]。2.4. 胚胎干细胞(ESC)ESC是全能细胞,可以分化为类肝细胞,具有损伤后能够在肝脏中定植的能力,并且具有与成熟肝细胞相似的功能[26]。但是,使用ESC有两个主要限制。首先,它们的采购涉及胚胎的破坏这一事实引起了道德上的担忧,这些担忧抑制了ESC研究的进展[27]。其次,ESC移植的供体和受体之间存在免疫不相容的问题[28]。尽管如此,ESC的研究仍在进行中,最近的一项研究揭示了一种分化为新生儿肝细胞的有效方案,该新生儿肝细胞能够在体内无肿瘤诱导地繁殖肝脏,并在对乙酰氨基酚引起的毒性小鼠中拯救肝脏功能[29] 2.5. 诱导多能干细胞(iPSC)iPSC具有与ESC相似的特性,包括多能性和自我更新,但避开了使用此类细胞固有的主要问题。 iPSCs是由体细胞在体外产生的,无需使用胚胎组织或卵母细胞,从而避免了伦理争议[30]。此外,它们提供了自体使用的可能性,解决了异体排斥的问题。 2006年首次描述的iPSC的使用已迅速发展为胚胎干细胞的有前途的替代方法,但在考虑将其应用于临床之前,必须解决几个问题,并且必须确定它们与ESC的等效性[ 32]。图1显示了iPSC和ESC之间的生产差异。 图1.胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的产生。 iPSC可能来自多种细胞来源,并且有人提出,它们的起源可能在它们的分化能力中发挥作用[33,34]。尽管成纤维细胞是人类iPSC(hiPSC)的最常见来源,但这些细胞也已成功地从多种其他体细胞类型(包括原代肝细胞)中重新编程[35]。然而,已经有人提出,与其他来源的细胞相比,肝细胞来源的细胞系对畸胎瘤形成的倾向可能更高。有证据表明,由于hiPSC系的表观遗传记忆力会随着时间的流逝而丢失,因此可以从多种来源的iPSC成功诱导肝分化[37]。实际上,研究表明,可预测的iPSC分化与体细胞来源无关,而是在很大程度上取决于所使用的重编程策略[39]。其他作者建议,相反地,iPSCs具有偏斜的分化潜能,这源于它们的谱系特异性表观遗传记忆,使它们易于分化为起源的细胞类型[40]。需要进一步的研究来阐明这一点,并找到最合适的细胞来源来产生能分化为肝细胞的hiPSC。还存在对iPSC进行重编程的不同方法,有关iPSC生成的第一份报告是由逆转录病毒载体组成的,用于诱导多能性。该方法受到病毒转基因自发再激活及其整合入宿主基因组的可能性的限制,这转化为形成肿瘤的风险[41]。但是,在过去两年中,成功解决了iPSC生成问题。例如,hiPSC现在可以由不整合到靶细胞基因组中的载体产生[42,43],甚至可以由小分子化合物诱导[44,45]。迄今为止,尚未从iPSC或ESC获得体外完全成熟的肝细胞。获得的称为肝细胞样细胞(HLCs)的细胞具有原代肝细胞的大部分特性,但功能上并不成熟,如其较低的白蛋白生成水平,CYP活性和尿素循环活性以及通过它们持续表达高水平的甲胎蛋白[46]。已经开发出许多分化方案[47-49],并且通过三步方案将分化时间从平均超过20天减少到12天,从而提高了其效率[50,51]。 Asgari等。 [52]将hiPSC衍生的HLC表征为表达肝细胞特异性标志物,糖原和脂质存储活性,白蛋白分泌和CYP450代谢活性,并且在移植后,这些细胞具有改善CCl4损伤的小鼠肝脏功能状态的能力[ 52]。最新研究集中在将成纤维细胞直接谱系重编程为人诱导的肝细胞,已产生具有药物代谢功能的功能性和可扩展性细胞[53,54]。尽管如此,分化方案必须在临床应用可行之前进行优化,因为已经表明完全分化的细胞移植后具有较低的畸胎瘤形成风险[55]。必须消除残留的未分化细胞,不仅避免畸胎瘤的形成,而且避免对多能性抗原产生免疫反应的可能性[56]。此外,分化后必须仔细研究目的细胞类型的免疫学特性[57,58]。必须克服的另一个障碍是缺乏高效,大规模的hiPSC生产系统,因为单层静态组织培养物将无法维持临床应用所需的快速细胞扩增。在这方面已经取得了进展,iPSC培养物以3D悬浮液的形式聚集[59]。 3D培养的优势是可以高密度培养hiPSC [60],同时可以增加HLC向成年表型的功能成熟度,并提高其功能寿命[61]。尽管有这些挫折,但仍取得了令人鼓舞的结果。朱等。 [62]能够通过缩短重编程规程以避免多能性,通过诱导多能祖细胞(iMPC)而不是iPSC来区分人成纤维细胞中的肝细胞[62]。然后,他们在人肝衰竭的免疫缺陷小鼠模型中实现了肝脏再填充,其肝细胞功能水平与人成年原代肝细胞相似。此外,通过阻止细胞进入多能状态,很可能防止了肿瘤的形成。已经发现,不涉及基因组整合的重编程方法以及通过在重编程过程中去除c-Myc均可降低iPSCs的致瘤性和免疫原性[64]。关于iPSCs的致癌潜力,最近在恒河猴中进行了自体畸胎瘤形成试验,得出的结论是,虽然未分化的自体iPSC形成畸胎瘤,但iPSC衍生的祖细胞在体内产生功能组织而没有肿瘤迹象形成[65]。此外,未分化细胞形成的畸胎瘤的生长效率比同等啮齿动物模型低至少20倍,这可能是由于完整的免疫和炎症系统的存在所致。它与人类生理学的相似性使这种非人类灵长类动物模型对于基于iPSC的疗法的研究非常有价值。 iPS细胞进行了研究,已经在许多不同的肝脏疾病的背景下对iPSC进行了研究,但是iPSC的最直接用途可能是人类肝脏疾病的建模和体外药物测试[66,67]。3. 干细胞用于肝病治疗的技术干细胞向HLC的分化可以在使用前在体外实现,也可以在细胞移植后在体内实现。体外培养和分化正在广泛研究中,并且仍在创造新的,更有效的方案。但是,干细胞在注射后也具有体内分化为HLC的能力。不同细胞系都是如此。在一项研究中,静脉注射纯化的造血干细胞显示出在富马酰乙酰乙酸水解酶(FAH)基因敲除小鼠体内向HLC分化,从而恢复了肝功能[68]。 FAH´ {´小鼠是I型酪氨酸血症的动物模型,在研究代谢性肝病的再生疗法方面具有巨大潜力。在这些动物中,非FAH缺陷型野生型细胞由于具有选择性优势,可以在移植后大量繁殖肝脏。当FAH基因敲除与免疫缺陷等位基因结合时,人类细胞可用于重新填充肝脏,形成嵌合器官[69]。为了提供更具临床意义的动物模型,还创建了FAH´ {'猪,可用于测试不同细胞疗法的功效[70]。此外,如果可以在这些动物中充分实现肝脏人源化,则可以将它们用作活体生物反应器,以生产大量功能性人肝细胞。图2显示了FAH基因敲除猪的创建及其作为原代人肝细胞培养箱的可能用途。 图2.用人类肝细胞填充FAH缺陷型猪肝。尼替农(NTBC)用于治疗FAH缺乏的动物,同时发生肝细胞移植和增殖。 其他细胞系,例如小鼠ESC和人类骨髓来源的MSC,也已被证明可以在体内分化为HLC [71,72]。尽管如此,在考虑临床应用之前,必须更深入地研究体外和体内信号模式,分化机制和最佳增殖条件,尤其是因为数据表明成熟肝细胞的移植和再繁殖能力要比干细胞高。 [73]。4. 干细胞在肝脏疾病中的潜在应用4.1. 遗传性肝病遗传性肝病中的细胞疗法不仅可以充当肝移植的桥梁,而且还为长期纠正代谢缺乏症提供了机会[74]。原代肝细胞移植已用于治疗人类的多种疾病,包括家族性高胆固醇血症,1型Crigler-Najjar综合征和尿素循环缺陷等[75]。同时患有Crigler-Najjar 1型和尿素循环缺陷的患者正在接受I期临床试验,以治疗由正常成人肝脏组织产生的异源人类成人肝脏祖细胞悬浮液[76]。但是,如前所述,供体器官不足,无法从中分离出高质量的肝细胞,必须考虑同种异体排斥的可能性。自体移植可以避免同种异体排斥,但是只能通过肝切除获得足够数量的自体原代肝细胞。可以通过使用iPSC来避免此问题。随着干细胞技术的发展,尤其是iPSC的发展,遗传性肝病的治疗可以进一步向前:通过将基因校正技术与自体细胞移植相结合,可以创建针对患者的治疗方法[77,78]。无病的自体hiPSC首先通过离体基因治疗产生[79],然后经过基因校正的hiPSC分化并用于移植。图3显示了如何将hiPSC与基因校正和分化技术结合起来以生产自体,无病的肝细胞进行移植。 图3. iPSC的基因校正,用于产生患者特异性无病肝细胞。 从理论上讲,这种方法可以应用于任何已知潜在突变的遗传性疾病,并且已经在造血疾病的动物模型上进行了测试,结果令人鼓舞[80]。在hiPSC中,α1-抗胰蛋白酶的缺陷也得到了基因纠正,从而在在小鼠的体内和体内分化的HLC中恢复了蛋白质的功能,[81]。家族性高胆固醇血症患者的hiPSC也已成功产生了经过疾病校正的HLC [82]。根据这些研究,自体基因校正的hiPSC衍生的肝细胞的移植显示出治疗遗传性肝病的希望。可以在4到5个月内获得针对患者的无病hiPSC系列产品[83]。另外,hiPSC可以用于遗传性代谢疾病的建模和研究[51]。4.2. 急性肝衰竭(ALF)如前所述,肝脏具有相当大的内源性再生能力[84]。当它遭受急性损伤时,修复机制就会生效,在许多情况下,修复机制将能够随着时间的推移恢复功能正常的存活肝[85],但是在再生过程中必须支持肝功能[86]。已经尝试了两种不同的方式:通过细胞移植或通过生物人工肝(BAL)系统。细胞移植可以为ALF或慢性慢性肝功能衰竭提供临时解决方案。 Pareja等。 [87]在急性慢性慢性肝衰竭患者中进行了肝细胞移植,取得了令人鼓舞的结果,包括改善高氨血症和脑病程度[87]。同样,永生化的人类胎儿肝细胞的移植显着提高了90%肝切除术后小鼠的存活率[88]。肝细胞与骨髓间充质干细胞的共包封不仅增加了移植[89],延长了肝细胞的生存能力,而且还增强了其在体内和体外的肝细胞特异性功能[90]。当单独移植时,骨髓来源的MSC可减轻小鼠的肝损伤并抑制肝内NK细胞活性[91,92]。此外,有证据表明,仅由MSC条件培养基产生的免疫调节就足以消除对供体肝细胞的需求[93]。 MSC衍生的外泌体也已被证明可以激活再生反应,从而在CCl4损伤的小鼠中导致增殖蛋白的更高表达[94]。与基于细胞的疗法相比,这些疗法的优势在于它们不太可能触发免疫反应。关于iPSC,Chen等。 [50]证明,在应用其三步分化方案后,iPSC衍生的HLC在严重的联合免疫缺陷小鼠模型中挽救了致命的暴发性肝衰竭[50]。BAL的另一种有希望的治疗方法是BAL,BAL是一种体外支持疗法,可以在执行活性肝细胞的生物转化和合成功能的同时去除毒素[95]。该系统旨在桥接ALF患者,使其通过再生来恢复天然肝脏或进行肝移植[96]。第一个被批准用于II / III期试验的BAL是基于猪肝细胞的装置,该装置在ALF患者的一项前瞻性,随机对照试验中进行了评估。对暴发性或亚暴发性肝功能衰竭患者进行亚组分析可提高生存率,但未达到整个研究人群生存的主要终点[97]。尽管原代猪肝细胞是BAL试验最常用的细胞来源[98],但永生化的C3A人肝母细胞瘤细胞也已在体外肝辅助装置(ELAD)中进行了试验[99],尽管尚无随机对照试验显示生存获益日期和荟萃分析结果尚无定论[100,101]。 HepaRG细胞是人类肝双能祖细胞系[102],能够在暴露于二甲基亚砜(DMSO)[103]后分化为肝细胞簇和周围的胆管上皮样细胞[103],目前正在阿姆斯特丹医疗中心进行BAL应用的评估(AMC)生物反应器,结果不一[104,105]。与无细胞BAL治疗相比,HepaRG-AMC-BAL已显示增加了ALF大鼠的存活时间[106]。为了成功地将BAL用于临床,似乎每种治疗方法至少必须可使用200 g功能性肝细胞。由于这个原因,由于原发性人类肝细胞的可用性有限以及它们在体外的短功能性和生存力,目前尚不实用。这些问题已通过使用肝细胞球体解决,该球体可保护细胞免于凋亡,并允许在治疗期间使用更大的细胞量[ 107 ]。猪肝细胞的使用也受到异种性和xenozoonosis的限制,而永生化细胞系的使用受到其基本细胞功能的丧失(如尿素循环和CYP酶活性)的限制[ 108]。因此,ESC和iPSC有望成为BAL设备的细胞来源。Soto-Gutierrez等。[ 109 ]显示,在90%肝切除的小鼠中,用皮下植入的BAL植入ESC衍生的HLC来治疗ALF可改善其肝功能,并延长其生存期[ 109 ]。iPSC的初步研究还表明,在生物反应器模块中培养7天后,这些细胞分化为HLC [ 110 ]。 时间限制是使用干细胞治疗ALF的主要限制之一。ALF疗法需要快速且有效地产生大量细胞,因此按照当前方案,培养和分化自体细胞所需的时间可能是禁止的,这使得同种异体肝细胞成为更实际的选择。一旦建立了有效且快速的分化为HLC的方案,使用HLA / MHC与HLA / MHC密切匹配的iPSC库是一项需要进一步研究的选择[ 108 ]。 点击:查看干细胞疗法治疗肝病(结论) 查看更多医学类文章免责声明:福昕翻译只充当翻译功能,此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的,仅代表作者个人观点,与本网站无关,版权归原始网站所有。仅供读者参考,并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等,请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。来源于:mdpi
2021-01-14 19:17:26