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Thapsigargin是主要人类呼吸道病毒的广谱抑制剂：冠状病毒，呼吸道合胞病毒和A型流感病毒 经过： 莎拉·贝塔吉（Sarah Al-Beltagi）克里斯蒂安·亚历山德鲁·普雷达利亚·古尔丁乔·詹姆斯Pu娟保罗·斯金纳江志敏王琳琳杨佳云阿什利C.肯尼斯·梅利兹帕维尔·格什科维奇（Pavel Gershkovich） 6，克里斯托弗·J·海斯乔纳森·阮·范·塔姆伊恩·布朗刘金华和张建洲1.诺丁汉大学动物医学与科学学院，萨顿·博宁顿，诺丁汉LE12 5RD，英国2.英国沃金GU24 0NF，Pirbright，Ash Road，Pirbright学院3.英国Addlestone KT15 3NB，Woodham Lane的Weybridge，动植物卫生局（APHA）4.中国农业大学动物医学院，农业部动物流行病学重点实验室，北京圆明园西路2号，北京1001935.英国诺丁汉萨顿博宁顿诺丁汉大学生物科学学院，LE12 5RD，英国6.英国诺丁汉大学公园诺丁汉大学药学院NG7 2RD，英国7.英国诺丁汉大学公园诺丁汉大学化学学院NG7 2RD，英国8.英国诺丁汉大学公园诺丁汉大学医学院NG7 2RD*应与之联系的作者。这些作者为这项工作做出了同等的贡献。 摘要：SARS-CoV-2和其他主要呼吸道病毒的长期控制策略除了明智使用有效疫苗外，还需要包括抗病毒药以治疗急性感染。虽然正在为大规模疫苗接种推出COVID-19疫苗，但针对任何疾病使用或开发的适量抗病毒药物证明了抗病毒开发的挑战。我们最近发现，无毒的毒胡萝卜素（TG）是肌腱蛋白/内质网（ER）Ca2 + ATPase泵的抑制剂，可诱导有效的宿主先天免疫抗病毒反应，从而阻止甲型流感病毒的复制。在这里，我们显示TG还可以在永生或原代人细胞中阻断呼吸道合胞病毒（RSV），普通感冒冠状病毒OC43，SARS-CoV-2和A型流感病毒的复制。 TG的抗病毒性能在抑制OC43和RSV方面显着优于瑞贝昔韦和利巴韦林。值得注意的是，TG在合并感染中对冠状病毒（OC43和SARS-CoV-2）和流感病毒（苏联H1N1和pdm 2009 H1N1）的抑制作用相同。酸稳定TG的感染后口服管饲法可保护小鼠免于致命的流感病毒攻击。结合其在主动感染之前或期间抑制不同病毒的能力，以及在TG暴露后至少48小时的抗病毒持续时间，我们建议TG（或其衍生物）是有希望的广谱抗SARS-CoV抑制剂-2，OC43，RSV和流感病毒。 关键字：毒胡萝卜素；抑制剂抗病毒物质; SARS-CoV-2;冠状病毒OC43；呼吸道合胞病毒;流感病毒广谱先天免疫;老鼠;瑞地昔韦利巴韦林;奥司他韦 1. 介绍在COVID-19大流行中，针对大规模疫苗接种的有效疫苗的需求从未如此大，以控制和预防可导致医院不堪重负的猖ramp的发病率，死亡率和激增的临床病例。 COVID-19是由一种新型冠状病毒引起的，该冠状病毒被称为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2），一种包膜的阳性单链RNA病毒[1]。尽管现在正在部署COVID-19疫苗，但根除是不切实际的，并且对有效抑制SARS-CoV-2抗病毒药[2,3]的平行需求存在着并行的需求，以抑制患者体内主动病毒复制以逆转病毒进程。考虑到并不是所有的疫苗都可以在随后的感染中预防病毒的脱落，因此抗病毒药也可以用来降低人群中传播的总体病毒水平，从而减少其传播。针对任何传染病使用或开发的抗病毒药物数量很少，证明了抗病毒药物开发的实际挑战。特别是对于呼吸道病毒，通常遇到的主要障碍是病毒突变抗性的出现，这种突变抗性源于直接针对病毒特定部分的普遍采用的策略。甲型流感病毒的N1部分对病毒神经氨酸酶抑制剂奥司他韦的耐药性日益引起人们的关注[4,5]。人们对令人担忧的是对新近引入的针对病毒PA蛋白的流感抗病毒药baloxavir marboxil的耐药性不断提高[6]；甲型流感病毒的PB1基因中的突变很容易赋予对新型核苷类似物抗病毒药物favipiravir的耐药性[7]。可以潜在地规避病毒突变挑战的另一种抗病毒设计方法是，在早期感染期间调节通用的宿主固有免疫反应，以充分破坏病毒复制，从而建立获得性免疫（抗体和细胞介导的）。这种新颖的以宿主为中心的抗病毒方法可以具有抑制不同类型病毒的额外好处[8]。鉴于表现出不同病因的急性呼吸道病毒感染在临床表现上是无法区分的，因此可以同时针对不同病毒类型的广谱以宿主为中心的抗病毒药可能会大大改变临床管理。除了目前的SARS-CoV-2大流行外，甲型流感病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）仍然是造成人类呼吸道病毒感染的重要因素。流感病毒是包膜的负义分段单链RNA病毒，每年在全球范围内导致多达65万例死亡，并且是造成先前大流行的原因[9]。 RSV是一种包膜的负义单链RNA病毒，是幼儿和老年人急性下呼吸道感染的主要原因，与5岁以下儿童的院内死亡48,000–74,500相关，其中99％在发展中国家发生的死亡[10,11]。虽然在甲型流感病毒感染中使用抗病毒药可能会受到病毒抗药性的阻碍，但仅批准使用抗RSV的化学抗病毒药利巴韦林仅限于婴儿的严重感染[5,12]。我们最近显示，毒胡萝卜素（TG）是肌浆网/内质网（ER）Ca2 + ATPase泵的抑制剂[13]，在纳摩尔非细胞毒性水平上诱导了有效的宿主抗病毒应答，从而阻断了甲型流感病毒的复制[14]。TG诱导的ER应激未折叠蛋白反应（UPR）似乎是激活宿主抗病毒防御下游谱的主要驱动力。在这里，我们显示TG实际上是一种以宿主为中心的广谱抑制剂，在永生或原代人类细胞中，可有效阻断RSV，普通感冒冠状病毒OC43，SARS-CoV-2和A型流感病毒的复制。我们还确定，胃中发现的TG是低pH稳定的，从一次引发起就能够快速诱导持续至少48小时的有效抗病毒状态，并且在小鼠口服后可在小鼠体内进行治疗性保护（体内）感染，应对致命的流感病毒挑战。 2. 材料和方法2.1. 细胞和病毒原代正常人支气管上皮细胞（NHBE）和支气管上皮生长培养基由Promocell（德国海德堡）提供。在添加了10％胎牛血清（FCS）的DMEM-Glutamax中培养无限增殖的新生猪气管上皮（NPTr）细胞[15]，HEp2细胞，MRC5细胞，A549细胞，Calu-3细胞，Vero E6细胞和MDCK细胞。100 U / mL青霉素-链霉素（P/S）（Gibco，ThermoFisher Scientific，佩斯利，英国）。通过DEFRA分离出的人RSV（A2株，ATCC VR-1540），苏联H1N1（A / USSR / 77），PR8 / H1N1（A / PR8 / 1934）和pdm H1N1病毒（A / Swine / England / 1353/2009）这项研究使用了SwIV监视程序SV3401）。还使用了人冠状病毒OC43（OC43）和SARS-CoV-2病毒（2019-nCoV /意大利-INMI1株，从EVAg获得的进化枝V（008V-03893）），后者的完整序列已提交给GenBank（SARS-CoV- 2 / INMI1-Isolate / 2020 /意大利：MT066156），并且可以在GISAID网站上找到（betaCoV /意大利/ INMI1-isl / 2020：EPI_ISL_410545）。 2.2. 细胞活力测定根据制造商的说明，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒或CellTiter-Glo 2.0细胞活力测定试剂盒（Promega，麦迪逊，威斯康星州，美国）确定细胞活力。 2.3. 细胞化学启动根据制造商的建议，将TG（美国密苏里州圣路易斯的默克公司）和瑞德昔韦（德国慕尼黑的Selleckchem公司）溶解在DMSO中，而利巴韦林和羟氯喹（默克公司）按照制造商的建议溶解在水中。化合物的抗病毒方案对细胞活力没有可检测到的不利影响。通常，除非另有说明，否则在感染前将细胞在适当的细胞培养基中稀释的所示化合物中孵育（稀释30分钟内使用），然后孵育30分钟，然后用PBS洗涤3次并用所示病毒感染（感染前启动）。或者，首先将细胞感染指定的时间，然后将化合物灌注30分钟，然后继续进行感染培养（感染后灌注）。细胞的所有TG引发仅持续30分钟，然后根据特定实验用PBS洗涤并进行下游培养。2.4. RSV感染和子代病毒定量HEp-2细胞，A549细胞和NHBE细胞根据24小时噬斑测定，在补充2％FCS的DMEM-Glutamax中以指定的RSV感染复数（MOI）感染48或72小时，收集的离心上清液用于噬菌斑测定或RT-qPCR的病毒拷贝数进行定量（请参见2.6节）。以前已经描述了通过噬斑分析对HEp2细胞进行RSV滴定[16]。简而言之，将感染细胞上清液的连续稀释液（一式三份）连续感染24小时的HEp2细胞固定在丙酮：甲醇（1：1）中，并使用小鼠抗RSV（2F7）抗体（1：1000）进行免疫染色（Abcam （英国剑桥）。2.5. 流感和冠状病毒的单一和共感染，以及子代病毒的定量甲型流感病毒感染需要无血清培养基和胰蛋白酶。 NPTr细胞和A549细胞的感染培养基是Opti-MEM I（Gibco），辅以100 U / mL P / S，2 mM谷氨酰胺和200 ng / mLL-1-甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮（ TPCK）胰蛋白酶（Sigma-Aldrich）。根据病灶形成试验（FFA），将特定的流感病毒MOI在感染培养基中感染细胞2到3 h，然后用PBS洗涤3次，并在新鲜感染培养基中孵育24天如图所示，持续72小时。收集纺丝上清液用于通过6 hFFA，50％组织培养物感染剂量（TCID50）或通过RT-qPCR的病毒拷贝数对子代病毒进行定量。以前已经描述了通过FFA滴定流感病毒[14]。在添加100 U/ mLP / S，2 mM谷氨酰胺和100 ng / mL TPCK胰蛋白酶的Opti-MEM I中，将A549细胞和MRC5细胞用指定的MOIOC43（基于FFA）感染OC43 3小时。用PBS洗涤3次，并在新鲜的感染培养基中孵育长达72小时。对用OC43和苏联H1N1病毒共感染的A549细胞进行了相似的处理。收集纺丝上清液用于通过FFA定量子代病毒或通过RT-qPCR定量病毒拷贝数。 在指示的MOI上，以TCID50为基础，用SARS-CoV-2将Calu-3，NHBE和Vero E6细胞感染，在补充有100U/mLP/ S，2 mM谷氨酰胺和100ng的Opti-MEMI中感染3 h。如图所示，将1mL / mL TPCK胰蛋白酶，随后在PBS中洗涤3次，并在新鲜的感染培养基中孵育总计长达72小时。对被pdm H1N1病毒和SARS-CoV-2病毒共感染的Calu-3细胞进行了相似的处理。收集纺丝上清液用于通过TCID50定量子代病毒或通过RT-qPCR定量病毒拷贝数。以96孔板形式进行TCID50滴定，以定量SARS-CoV-2和A型流感病毒，最少重复四次。在生长培养基DMEM（Gibco）中对每个样品进行十倍稀释。然后，将50µL稀释样品分别添加到MDCK和VeroE6细胞中用于流感和SARS-CoV-2滴定，并在37°C下孵育1 h。然后将培养基换成200 µL DMEM（补充200ng /mL TPCK胰蛋白酶用于流感滴定），并在37℃下孵育5天。在显微镜下评估每个孔的细胞病变作用。使用Spearman-Karber方法以TCID50计算病毒滴度[17,18]。检测限为5.62 TCID50 / mL。2.6. RNA制备和实时RT-PCRRNeasy Plus Minikit（Qiagen，希尔登，德国）用于从细胞中提取总RNA。使用Superscript III First Strand合成试剂盒（ThermoFisher Scientific）从1 µg总RNA合成cDNA。用LightCycler 96仪器（Roche，Basel，Switzerland）进行宿主基因的表达。基因表达的计算基于比较的Ct方法，已标准化为18S核糖体RNA。 HSPA5（FH1_HSPA5和RH1_HSPA5），HSP90B1（FH1_HSP90B1和RH1_HSP90B1）和DDIT3（FH1_DDIT3和RH1-DDIT3）的人ER应力引物;和人类IFNB1引物（FH1_IFNB1和RH1_IFNB1），OAS1引物（FH1_OAS1和RH1_OAS1）和RNASEL引物（FH1_RNASEL1和RH1_RNASEL1）是预先设计的Sigma-Aldrich。使用PrimerExpress 3.0.1（ThermoFisher Scientific）设计了其他引物（由Sigma-Aldrich合成），并在表1中显示。QIAamp病毒RNA试剂盒（Qiagen）用于从离心细胞培养上清液中提取病毒RNA。使用QIAGEN OneStepRT-PCR KIT进行一步实时qPCR，以定量相对病毒拷贝数。 表1.引物序列。 基因没有第一（5d – 3d）反义引物（5j–3j）18S核糖体RNA（通用）ACGGCTACCACATCCAAGGACCAATTACAGGGCCTCG-AAA F基因（RSV）CAAGAACTGACAGAGGATGGTACTGCATGTTTCAGCTTGTGGGAAGAL基因（RSV）AACACTTATCCTTCTTTGTTGGAACTTAGCAACCGAAACTCACGATAGAAAM基因（RSV）ACTCAAGAAGTGCAGTGCTAGCAAAGGACACATTAGCGCATATGGTRIG-I（人类）GAAGGCATTGACATTGCACAGTTGGTTTGGATCATTTTGATGACAM基因（苏联H1N1）AGATGAGCCTTCTAACCGAGGTCGTGCAAAAACATCTTCAA-GTCTCTGM基因（pdm H1N1）AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGTGCAAAGACACTTTCCA-GTCTCTGOrf1ab（SARS-CoV-2）CCGATCATCAGCACATCTAGGTTGACAAGGCTCTCCATCT-TACCTTTOrf1ab（OC43）GCCAGGGACGTGTTGTATCCTTGATCTTCGACATTGTGACCTATG 2.7. 蛋白质印迹使用放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液（圣克鲁斯，达拉斯，美国德克萨斯州）补充1％苯基甲基磺酰氟（PMSF）（圣克鲁斯），1％抑制剂混合物和1％原钒酸钠，裂解细胞，并通过Bio-RAD蛋白质测定法（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）测量蛋白质浓度。一抗是1：500稀释的山羊抗甲型流感A1（Abcam，ab20910），小鼠抗甲型M2克隆14C2（1：1000）（Invitrogen，MA1082），山羊抗甲型流感病毒多克隆抗体以1：2000的稀释度（Abcam，ab155877），小鼠抗冠状病毒抗体OC-43株，克隆541–8F处于1：1000（Sigma-Aldrich，MAB9012）和小鼠抗β-肌动蛋白克隆AC- 74处于1：5000（Sigma-Aldrich，A2228）。合适的物种特异性二抗是过氧化物酶偶联的（Abcam），用于化学发光检测（Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent，美国马萨诸塞州马尔伯勒）。2.8. 干扰素-β（IFNβ）ELISA通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量细胞培养上清液中的IFNβ分泌。 IFNβELISA（人类IFN-βQuantikine ELISA试剂盒，美国明尼苏达州明尼阿波利斯市Bio-Techne）按照制造商的说明进行。样品进行三次重复分析。2.9. 小鼠流感病毒挑战为了评估TG在感染过程中（即感染后）的抗病毒效力，并与体内奥司他韦进行比较，将6至8周龄的BALB / c小鼠（雌性）分为两组，以确定感染后存活率（每个治疗组n = 8）和子代病毒产生（每个治疗组n = 8）。小鼠经鼻内感染了3个MLD50的PR8/H1N1病毒。感染后十二小时，每天通过管饲法口服TG（1.5 µg / kg /天），奥司他韦（45 mg / kg /天）或PBS + DMSO（PBS-DMSO对照中DMSO的百分率与其他治疗相当）天。在感染后第3和5天，收集每组四只小鼠的肺以进行病毒滴定。通过TCID50分析，对接种了10倍连续稀释的均质化肺组织的MDCK细胞进行病毒滴定，并在37°C下孵育72小时。 TCID50值是根据Reed–Muench方法[19]计算的。 2.10. 量化与统计分析使用GraphPad Prism 7和图例中描述的统计方法进行统计分析。 p值<0.05被认为是显着的，并表示为* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001和**** p <0.0001。 Kaplan–Meier方法用于生存分析。给出的结果代表了三个或更多个独立的重复，除非另有说明，否则误差线为标准偏差。2.11. 道德声明所有动物工作均已获得北京科学技术协会（ID：SYXK（Beijing）2007–0023）的批准，并按照北京实验动物管理委员会发布的《北京实验动物福利和道德规范》进行；符合中国农业大学机构动物护理和使用委员会指南（ID：SKLAB-B-2010–003）。3. 结果3.1. TG阻止子代RSV生产为了证明TG对RSV的抗病毒活性，在感染前24小时（图1A）或感染后24小时（hpi）（图1B）用TG短暂灌注人HEp2和A549细胞30分钟。每种细胞类型的感染前和感染后TG引发导致后代病毒产量显着下降（统计上显着）。感染前用0.5 µM TG引发的HEp2细胞将子代病毒的产生减少了近10,000倍（图1A）；在24 hpi时用0.5 µM TG引发的细胞将病毒输出降低约1000倍（图1B），这分别表明其对RSV的预防和治疗抗病毒潜力。用TG对HEp2和A549细胞进行30分钟的单次启动诱导了有效的抗病毒状态，这种状态持续至少48小时（图1C，D）。 TG引发HEp2细胞（感染前即刻或感染前48小时）引发了病毒L，F和M基因的转录抑制（图1E，F）。所用TG的抗病毒方案对HEp2和A549细胞无细胞毒性（图1G，H）。补充证据TG的非细胞毒性抗病毒剂量方案已在我们较早的出版物中发现[14]。因此，TG作为一种非细胞毒性抑制剂具有快速作用，可在持续至少48小时的细胞中诱导抗病毒状态，并且在主动RSV感染之前或期间使用时是有效的。 接下来，根据被感染的HEp2细胞的后代病毒产量（图2A）和病毒RNA检测（图2B），将TG的抗病毒性能与病毒唑进行比较，利巴韦林是一种被批准用于严重RSV感染的幼儿的抗病毒药物。 TG在阻止RSV复制方面优于病毒唑。例如，用0.1µM TG感染HEp2细胞预感染30分钟对子代病毒产生的抑制作用比连续使用30 µM利巴韦林（50％利巴韦林有效浓度（EC50）对RSV = 11）高160倍。 µM [20]）（图2A）。 TG在HEp2细胞的RSV抑制中表现出984的选择性指数（50％（CC50）/ EC50的细胞毒性浓度）和84.55 nM的EC90，这表明它具有很强的安全裕度（图2C，D）。在由TG引发和感染的原代NHBE细胞中，相应培养基中病毒RNA的检测降低（图2E）与病毒L，F和M基因的转录抑制（图2F）同时发生，这进一步表现为TG剂量依赖性减少病毒蛋白的产生（图2G，H）。 两者合计，TG作为抗病毒剂比利巴韦林更有效，表现出很强的选择性指数，并阻断了RSV病毒的转录和病毒蛋白的产生。在原代NHBE细胞中，相对于DMSO对照，在RSV感染之前和期间，TG依赖于TG的剂量以TG剂量依赖性的方式进行了TG的感染前致敏增强ER应激基因（DDIT3，HSPA5和HSP90B1）的表达（图3A，C）。TG还增加了NHBE细胞中RIG-I信号相关基因（RIG-I，IFNB和RNASEL）的基础表达，但是在感染过程中，相对于被感染的DMSO对照，RIG-I相关基因的诱导显着衰减（图3D，G）。因此，在NHBE细胞中RSV感染期间，RIG-I相关基因的转录诱导减少是一个特征。TG介导的RSV抑制作用。3.2. TG阻止子代冠状病毒OC43的生产为了证明TG对冠状病毒的抑制作用，在感染地方性OC43病毒之前，立即用TG引发A549细胞30分钟[21]（图4A–C）。以剂量依赖性方式，TG阻断了病毒复制，如感染细胞的培养基中病毒RNA的急剧减少（图4A），病毒转录的抑制（图4B）和病毒NP蛋白生成减少（图4C）所证明。将TG的抗病毒性能与羟氯喹（HC）进行了比较，后者是一种毒性比氯喹低的化合物，可抑制OC43[22]。 TG在阻止子代OC43病毒产生方面比HC更有效（图4D，E）。感染前引发与整个感染过程中连续使用20 µM HC相比，0.05 µM TG仅持续30分钟对OC43的抑制作用更大（针对SARS-CoV-2的HC EC50 = 4.51 µM [23]）（图4D）。与HC处理后代病毒的适度减少不同，在TG引发的感染细胞的培养基中几乎未检测到任何病毒（图4E）。在A549细胞中，TG在阻止OC43病毒（图4F）和流感病毒（图4G）复制方面比最近被批准用于SARS-CoV-2感染紧急使用的核苷类似物Remdesivir（RDV）[24]更好。 。尽管在72hpi时，细胞连续暴露于0.3 µM RDV（RDV EC50对OC43 = 0.15 µM [24]）显示约17,000倍减少子代病毒RNA的检测（相对于相应的DMSO对照）；细胞反过来，用0.3 µM TG引发的细胞则比RDV处理过的细胞具有450倍的抑制作用（图4F）。在72 hpi时，与0.3μM的RDV连续使用相比，0.05μMTG引发的细胞对苏联H1N1病毒的抑制作用还强于7倍。 RDV对流感病毒复制几乎没有抗病毒作用（图4G）。 TG在A549细胞中的抗病毒用途无细胞毒性（图4H）。 TG在MRC5细胞中OC43上的TG的选择性指数（CC50 / EC50）高，介于7072和9227之间（图4I）。总的来说，TG强烈抑制OC43病毒的转录和蛋白质产生，作为抗病毒剂比HC和RDV更有效，并且具有较高的选择性指数。 点击：查看文章剩下部分 查看更多医学文章 查看更多冠状病毒文章 使用专业文章翻译功能免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网站无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。 来源于：mdpi

查看心脏骤停中的ECMO：文学叙事回顾 7. 神经学结果 不管插管时的心率如何，ECPR都能优化因室颤和/或心动过速（VF / VT）导致难治性CA患者的器官灌注。通过达到血液动力学稳定性，ECPR可以阻止缺血性病变的发展，而不必获得自发性循环（ROSC）的恢复。因此，它为纠正长时间的心肺复苏过程中出现的严重代谢紊乱提供了时间，并使治疗可能导致难治性VF / TV持续的潜在病因成为可能。这些稳定策略与难治性CA患者的生存改善和令人满意的神经学预后有关[10,69,79]。此外，ECPR能够使患者在36℃的恒定温度下稳定24小时[80]。 在明尼苏达大学的ECPR队列研究中，在开始ECMO之前受益于CPR协会（持续20至29分钟）的患者中，有100％的患者神经功能预后良好。常规心肺复苏组的结果微乎其微，其中只有24％的患者存活下来并具有令人满意的神经学预后。与传统的心肺复苏术组相比，心肺复苏术显示了最长98分钟的心肺复苏持续时间。ECMO发作前的缺血性损伤似乎是预测预后的决定性因素。在同一队列中，超过29分钟的CPR，每10分钟的存活率下降25％[81]。先前的研究还表明，CPR的持续时间与ECPR期间的生存之间存在联系[4,16,82]。 ECPR可以在延长心肺复苏后提高生存率，但是避免对那些仅使用常规心肺复苏就可以幸免的人造成伤害是值得关注的。 OHCA受益于常规CPR的患者的最新研究表明，由医疗专业人员在最长28至39分钟的CPR中，有幸存的神经系统状态令人满意的患者中有99％接受了ROSC [83-86]。 大多数ECPR计划都要求将患者运送到医院植入ECMO。因此，至关重要的是估计传输指示的时间。确实，将患者转移至心脏骤停状态可能会降低复苏的有效性，并有可能阻止某些患者的生存。雷诺兹等。 [85]研究了从观察性研究中收集到的符合ECPR标准的患者中晚期疗法与转运风险之间的关系。他们包括年龄在18至65岁之间的患者，在有证人在场的情况下发生心脏骤停，在10分钟内开始进行心肺复苏，并且没有心搏停止作为最初的心律。他们发现90％的神经功能预后良好的幸存者在21分钟内有ROSC，如果CPR延长至20分钟以上，则存活的神经功能预后良好的可能性为8.4％。作者建议在进行ECPR运输之前，先进行21分钟的标准复苏。 在临床实践中，建议立即转运对最初的复苏措施无反应的心脏骤停患者是合理的。实际上，在欧洲的建议中，执行第一批专门的复苏措施大约相当于10分钟。因此，建议将这段时间用于考虑ECPR的运输。如前所述，在“转移决定”和“有效转移”之间加上最短的时间后，可以将转移时间提高到大约20分钟的CPR。 一些中心建议使用自动按压板进行胸部按压。但是，在最近的荟萃分析中，证据水平并不表明包括机械式胸部按压设备的CPR算法优于传统的手动胸部按压技术。在无法进行高质量的手动胸部按压或危险的情况下（例如，很少有救生员，低温CA中的救护人员长时间使用CPR，在救护车中，受过训练的医疗服务提供者使用的机械胸部按压器）是手动胸部按压的合理替代品。在血管造影室或ECPR准备期间）[87]。此外，其他研究者表明，在使用装有机翼方法的担架上移动住院的CA患者时，胸部按压可以产生高质量的胸部按压[88]。 ECPR成功的时间竞赛对此类协议的实施具有重要意义。对于目前的院前复苏技术，建议建议在实施ECMO治疗难治性OHCA之前，最佳的CPR时间间隔为30分钟。但是，ECPR的生存益处可能会超过60分钟。因此，ECPR程序应旨在在不到30分钟的时间内使可插管的患者数量最大化，而不必排除复苏时间较长的患者。 院前护理的未来优化还可以提高与ECPR相关的生存率。院前CPR策略可改善CPR的灌注或减少患者的代谢需求，可延长有效CPR的时间，从而延缓缺血性损伤的发作。院前ECPR的启动也可以提供快速的稳定。迄今为止，最近发表了关于ECPR在OHCA患者中应用的最大研究。它提供了有关该策略有效性的新信息。 Bougouin等。 [16]报道了巴黎大都会地区超过13,000例OHCA病例。在接受常规心肺复苏术的12396名患者中，有8.6％（1061）可以存活出院，而523名ECPR患者中只有8.4％（44）。尝试进行ECPR，但11％（58）的患者无效。 ECPR组中有利于生存的因素包括短暂恢复自发性循环（ROSC）以及ECPR之前的最初令人震惊的心律。应当指出，院前ECPR与入院后接受ECPR的患者相比，与生存率更高（OR 2.9，95％CI 1.5–5.9，p = 0.002）和更有利的神经系统结果（OR 2.9，95％CI 1.3–6.4，p = 0.008）相关。 但是，这项研究有很多局限性，包括选择偏见。启动ECPR的决定是由每个临床医生自行决定的，而不是严格按照预先建立的算法，从而提供了大量潜在的混淆因素。 ECPR患者基线描述的差异表明了这一点。目击者较年轻且更倾向于从CPR中受益（81％vs. 49％，p <0.001），但更相关的是，他们接受了超过30分钟的长时间CPR（99％vs. 77％，p <0.001） 。作者试图通过多元分析（OR 1.3，CI 95％0.8-2.1，p = 0.24）或倾向分析（OR 0.8，95％CI 0.5-1.3，p = 0.41）校正已知的混杂因素，但是他们无法确定ECPR是否与医院环境中的生存改善相关。研究亚组之间存在许多差异，尤其是在没有ROSC的患者和具有不可电击节律的患者之间。 ECPR可能在这些亚组中表现出不同的结果，也许将来需要专门研究对其进行研究[16]。 更相关的是，未检查神经系统结局和长期生活质量。希望不将分析局限于医院的死亡率，而要分析诸如功能恢复和具有可接受的神经后遗症的长期存活的因素[89,90]。这项研究将继续成为机械支持设备的信奉者，以及他们在改善心脏骤停过程中可能发挥的作用方面。这将刺激该领域的进一步研究，以纠正在患有OHCA的患者中观察到的不良结果。受益于ECPR的患者与接受常规RCP治疗的患者在生存率上没有统计学上的显着差异，这需要重新评估ECPR在OHCA患者中的作用。这最后的出版物确实具有许多品质，包括大量患者，参与小组的功能经验以促进ECPR的迅速实施及其提供“真实”数据的多中心观察设计。最后，ECPR是一种机械支持形式，需要特别复杂和庞大的人力和技术资源组织。它还需要在极端条件下进行插管的从业人员非常高的专业知识。因此，对于维持这些类型的计划至关重要的是，要确保有足够的干预措施，并允许相关专业人员的大量接触，以维持高质量的护理标准。 8. 结论 CA仍然是常见的死亡原因和主要的公共卫生问题。迄今为止，常规的心肺复苏术是唯一可用于改善这些患者预后的有效复苏程序。 ECMO是一项复杂且价格相对较高的技术，需要专业知识。因此，它不能在所有医院都使用，而必须在定期执行这些程序的高容量中心进行。ECPR可使传统CPR难治的CA患者获得血液动力学和呼吸稳定，并通过保留器官灌注来开始治疗CA的根本原因。但是，目前的证据并不支持在所有难治性CA患者中常规使用ECPR的建议。因此，似乎关键适当选择那些谁可能会从它的使用中受益患者。这可能包括存在即将死亡风险的患者，这些患者具有专门设计的评分，可以预测与使用ECPR相关的生存获益。使用它的理想好处将是进行足够的复苏，从而促进中长期生存可接受的神经系统结果。最后，通过额外的医院ECPR来最佳管理难治性CA患者的方案仍然是研究的活跃领域。 作者贡献：A.D.C.设计研究，选择文章，收集数据并撰写手稿。 B.A.选择文章，收集数据并撰写手稿。多发性硬化症。写手稿，N.M。收集数据并写手稿C.B.收集数据并写手稿K.B。设计研究并撰写了R.G.设计研究，选择文章，收集数据并撰写手稿。所有作者均已阅读并同意该手稿的发行版本。 资金：这项研究没有获得外部资金。 数据可用性声明：不适用。 利益冲突：作者声明没有利益冲突。 参考文献（展示部分文献，可去原文章查看全部） 1. 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3.5.美拉德反应产物：黑色素和丙烯酰胺我们小组进行的另一项胃肠运动的影像学研究评估了先前提到的咖啡银皮水提物中黑色素的作用[178]。咖啡银皮是咖啡豆外层的皮料，约占咖啡樱桃的4.2％（w / w），是咖啡烘焙过程中产生的唯一副产品[179]。咖啡银皮已被提议作为益生元，抗氧化剂和膳食纤维的可持续天然来源[180]。咖啡银皮提取物的抗氧化特性是由于CGA的存在[181]，也归因于黑色素在烘烤过程中产生的[182]。黑色素是在美拉德反应的最后阶段产生的高分子量棕色聚合化合物[183]，而衍生自咖啡的那些被称为“美拉德化膳食纤维” [184]。因此，在健康的雄性Wistar大鼠中，以1 g/ kg的饮用水剂量在体内研究了纤维效应。 4周后，大鼠通过管饲法接受硫酸钡，然后在0-8小时后拍摄X光片。另外，进行结肠珠排出试验以具体确定对结肠推进的可能影响。与先前关于SCG的研究一致，黑色素加速了小肠的转运（因为暴露于黑色素的大鼠中盲肠的到达速度明显快于对照动物），并且倾向于加速粪便颗粒的形成，尽管这种作用并不明显。有趣的是，来自黑色素组的粪便颗粒倾向于稍大，这可能是由于该组中较高的纤维摄入量所致，从而使粪便颗粒在机械刺激结肠方面稍微更有效。此外，黑色素没有显着改变插入结直肠3 cm的珠子的排出潜伏期，表明在此水平上参与结肠推进的运动因子（内在和外在神经支配，平滑肌和ICC）没有改变。饮食接触咖啡银皮产生的类黑素，它们可能被用作功能性食品成分[178]。有趣的是，Argirova等。 （2010）[185]表明，黑素能作用于肌张力，并可能促进Ca2 +流入分离的胃肌层细胞。因此，这些化合物不仅可以通过纤维作用，而且可以通过胃肠道平滑肌细胞的直接活化来发挥其促动力作用，这需要使用分离的肠道肌肉组织来证实。如上所述，丙烯酰胺是由于之间的美拉德反应而形成的。加热过程中的氨基酸和糖[186]，也发生在咖啡烘焙过程中。尽管很难评估人体中丙烯酰胺的饮食摄入量，但一般人群的估计饮食摄入量为每天0.3-0.8 µg /kg体重[187]。这是由于不仅暴露于咖啡，而且还暴露于可能也含有丙烯酰胺的其他食品（薄片，谷物）和工业产品（与聚合物，胶水和纸张有关的那些，水处理和化妆品工业[126]）。相关浓度会影响人类健康。尽管消化道是丙烯酰胺吸收的主要途径之一，而且包括咖啡在内的含丙烯酰胺食物的摄入量仍在增长，但几乎没有评估其对ENS神经元的作用，但这很重要因为丙烯酰胺是周围神经系统的毒素。在肠道肌层神经元，平滑肌细胞和神经胶质细胞的共培养模型中研究了丙烯酰胺的影响[188]。在这项研究中，将丙烯酰胺以0.01 mM至12 mM的剂量添加到共培养物中，然后孵育24、96或144 h。与肉毒杆菌毒素A（也在同一系统中进行测试并且仅改变神经元功能）相反，当以0.5–2mM的剂量使用时，丙烯酰胺会破坏肠道神经元结构。在这些剂量下，损伤对轴突结构是选择性的，而不影响存活，而在较高剂量下，神经元的存活显着降低。轴突丢失伴有乙酰胆碱释放减少，这在4 mM时可忽略不计。该机制涉及突触囊泡的合成和功能，但不涉及胆碱的摄取。高剂量的神经元损失主要涉及坏死机制，尽管也证实了非胱天蛋白酶3介导的凋亡死亡的频率较低。有趣的是，还显示出在低剂量丙烯酰胺攻击后，轴突再生是可能的。实际上，在低剂量攻击后的24-96小时内，轴突的生长比对照培养的细胞更快，这表明在最初的破坏性侵害之后，补偿机制的参与。但是，发现神经递质的释放至少要延迟几天才能到达轴突再生长。有趣的是，所描述的所有变化都对神经元具有选择性（与潜在的表型无关），肠神经胶质细胞显然未受到影响[188]。口服给实验动物后，丙烯酰胺也被证明对ENS产生神经毒性作用。早期研究显示ENS的变化，丙烯酰胺治疗的大鼠类似于链脲佐菌素诱导的糖尿病动物，但儿茶酚胺能含量发生改变，降钙素基因相关肽（CGRP）的量减少，血管活性肠肽（VIP）水平相应增加[189]。但是，这些研究并未评估这些变化是否与神经元丢失，轴突变性或功能改变有关。最近，已经在猪模型中研究了丙烯酰胺给药的作用。结果表明，即使低剂量的丙烯酰胺也会影响胃肠道的结构和功能，并引起ENS神经元的显着反应。例如，可卡因和苯丙胺调节的转录本（CART）的表达在应激刺激和神经保护的神经元反应中起着至关重要的作用，特别是在接受低剂量的未成熟母猪的小肠肌层丛中或通过口服途径高剂量的丙烯酰胺治疗28天，这被解释为是对这种病理刺激作出响应的胃肠道神经元保护/恢复过程的一部分[190]。甘丙肽是另一种具有神经保护作用的肽，可调节神经损伤后的存活或再生并发挥抗炎活性[191,192]。因此，在相同的猪模型中，即使在低剂量下，胃中粘膜下层和肌间神经丛的甘丙肽样免疫反应神经元的数量也会增加。此外，对甘丙肽具有免疫反应性的同时对VIP，nNOS或CART具有免疫反应性的细胞的粘膜下层和肌层神经元细胞也有所增加。作者再次将这些发现解释为甘丙肽的神经营养/神经保护作用（可能与VIP，nNOS和CART协同作用）在丙烯酰胺中毒后胃ENS的恢复过程中[193]。该系列的另一篇论文于2019年发表，在猪十二指肠中发现了相似的结果。与以前一样，通过口服途径以低剂量（0.5 µg / kg）的每日剂量使用丙烯酰胺，或以10倍剂量（5 µg / kg）的口服途径使用丙烯酰胺4周。两种治疗均导致对P物质（SP），CGRP，甘丙肽，nNOS和囊泡乙酰胆碱转运蛋白（VACHT）免疫反应的神经元百分比显着增加，尽管高剂量会引起更强烈的变化。在这种情况下，作者给出的解释是，所有这些变化可能都是补偿性的塑性作用，试图保护神经元免受损害并恢复肠道神经元稳态[194]。值得注意的是，尽管丙烯酰胺会在体内和体外激活小胶质细胞，从而导致促炎性细胞因子的释放，并因此导致神经元损伤[195]，但肠神经胶质细胞参与由丙烯酰胺诱导的肠道神经元改变尚无明确报道。除上述研究使用肠肌神经元神经元，平滑肌细胞和神经胶质细胞共培养，并且在最后一种细胞类型中未显示任何丙烯酰胺诱导的改变外，尚未进行评估[188]。4.咖啡和脑肠轴如前所述，咖啡是化合物的天然来源（图4），能够在脑肠轴上发挥关键作用[196]。有趣的是，在Pubmed中将“脑肠轴”和“咖啡”组合为关键字时，仅检索了三篇论文（截至2020年11月29日），其中两篇以咖啡与PD的关系为主导（请参见下文）[ 197,198]。另一个是Papakonstantinou等人最近的一项研究。[199]，他对40位健康的年轻人（20-55岁）进行了一项随机，双盲，交叉的临床试验（ClinicalTrials.govID：NCT02253628），以研究200毫升含160毫升咖啡饮料的效果mg咖啡因（冷热速溶咖啡，冷浓缩咖啡，热过滤咖啡）对（1）自我报告的胃肠道症状，（2）唾液胃泌素，（3）压力指数（唾液皮质醇）和α-淀粉酶）和心理测量，以及（4）血压。重要的是，参与者是每天的咖啡消费者，并且该研究是在无压力的情况下进行的条件。咖啡对自我报告的焦虑水平没有影响。此外，参与者在与胃肠道阴性症状（例如，腹部不适，腹胀，消化不良和胃灼热），慢性压力和负面情绪有关的所有问题中均得分很低（十分之1），而得分较高（10分钟有9分）关于积极情绪的所有问题。饮用咖啡后，唾液中的α-淀粉酶活性显着提高，仅在摄入后15分钟和30分钟时冷速溶咖啡和过滤后的咖啡之间存在显着差异。不论咖啡类型如何，唾液胃泌素暂时增加，而唾液皮质醇或自我报告的焦虑水平不受影响。但是，在实验期结束时，血压显着升高（但在健康的生理水平内），与咖啡的类型/温度无关。尽管许多研究已经解决了咖啡和咖啡因对心血管和中枢的影响，但Papakonstantinou等人的报告指出。似乎是唯一一项在相同的个体和相同的条件下专门评估它们对整个脑-肠轴影响的研究。因此，证明了在非压力条件下的急性咖啡摄入与胃肠道症状无关，但激活了交感神经系统，与唾液中的α-淀粉酶和血压升高有关，但与唾液皮质醇无关，这被认为是由于可能是咖啡的抗应激作用[199]，可能是咖啡因以外的其他咖啡化合物造成的。因此，重要的是，不仅要研究咖啡，还要研究其成分对脑肠轴的影响。图4.咖啡化合物对脑肠轴的影响。缩写：CGA，绿原酸； GABA，γ-氨基丁酸。 4.1.咖啡因咖啡因是咖啡中发现的主要精神活性化合物（表1）。它是从饮食中摄取并吸收到血液中，刺激交感神经系统活动，并容易穿过血脑屏障（BBB），对中枢神经系统（CNS）也具有刺激作用[196,200]。咖啡因通过调节不同的神经元途径对中枢神经系统有影响。因此，在动物和人体研究中，都发现咖啡因暴露后多巴胺能系统发生了变化[201]。不同的研究表明，咖啡因会增加细胞外多巴胺的浓度[202]，以及多巴胺能受体和转运蛋白的表达[203]，从而导致认知功能障碍和注意力的改善[204]。此外，据报道，咖啡因能够抵抗多巴胺能神经元的丧失，在动物模型中诱导神经保护并减轻神经系统疾病[205]，这在PD的背景下可能特别有用。（见下文）。然而，精神分裂症和成瘾中的多巴胺能活性增加。因此，在这些患者中也必须考虑咖啡和咖啡因的作用。重要的是，由于不同的原因，精神分裂症患者的咖啡和咖啡因摄入量相对较高，包括缓解无聊和冷漠的意愿或抗精神病药物的副作用，如镇静或口干[206]。通常，建议这些患者减少咖啡消耗量[207]。另一方面，据报道咖啡因和谷氨酸能信号传导之间可能存在相互作用。长期摄入咖啡因可减轻成年雄性C57BL / 6小鼠的胚细胞诱导的记忆障碍，这与在损伤的不同阶段对谷氨酸兴奋性毒性，炎症，星形胶质增生和神经元丢失的神经保护作用相关[208]。此外，摄入咖啡因还可以减少海马中谷氨酸能神经末梢的丧失，从而恢复糖尿病引起的小鼠记忆功能障碍[209]。此外，发现咖啡因会降低γ-氨基丁酸（GABA）能量系统的活性并调节GABA受体，从而导致神经行为效果[201]。长期摄入咖啡因可能与GABA的长期减少有关[210]。最后，Jee等人的最新评论。 （2020）指出，咖啡因的摄入对男性和女性都有不同的神经和精神病学影响[211]，突出了评估性别对咖啡及其成分对脑肠轴影响的影响的重要性。特别是，作者表明，摄入咖啡因可降低女性中风，痴呆和抑郁症以及男性PD的风险。然而，咖啡因对男性和女性青少年都有增加睡眠障碍和焦虑增加有负面影响[211]。4.2.多酚类咖啡也是CGA（表1）的来源，CGA是一种羟基肉桂酸，具有抗氧化、抗菌和抗炎等促进健康的作用[212]。大多数摄入的CGA被水解为CA和奎宁酸，并被肠道微生物群进一步代谢为各种芳香酸代谢物[213]。关于CGA及其代谢物穿越血脑屏障的能力存在争议[214215]。然而，由于其抗氧化和抗炎特性而产生的神经保护作用之前已经被描述过[215]。正如咖啡因所提到的，CA和CGA是具有抗氧化特性和对多巴胺能神经毒性具有神经保护作用的咖啡成分[216,217]，已被认为是降低与咖啡消费有关的PD风险的基础[218,219]。有趣的是，PD的主要症状之一是便秘，似乎在PD运动症状出现前10-20年已经出现[220]，较低的排便频率预示着未来的PD危机[221]。此外，PD患者和动物模型中会发生神经变性，有力的证据表明PD可从ENS开始并通过迷走神经从那里扩散到CNS [222,223]。在最近的报告中，在鱼藤酮诱导的PD小鼠模型中测试了CA或CGA [224]。在该模型中，将小鼠皮下植入一个渗透微型泵，以2.5mg/kg /天的剂量给予鱼藤酮（相当于通过农药暴露于鱼藤酮的环境水平），持续4周。从鱼藤酮暴露前的第一个星期开始，直至暴露结束，每周5天施用CA（30mg/ kg/天）或CGA（50 g/ kg /天）。处死后评估治疗对中枢多巴胺能和肠神经元的作用，并在鱼藤酮治疗结束后1天进行治疗。此外，将大鼠肠神经元和胶质细胞的培养物暴露于鱼藤酮（1-5nM）或不暴露于CA（10或25 µM）或CGA（25 µM）。值得注意的是，除了对与PD相关的中心结构和细胞（即，黑色素多巴胺能神经元）产生有益影响外，和星形胶质细胞），这证明了CA或CGA的施用至少部分地阻止了鱼藤酮诱导的变化，鱼藤酮既影响了治疗小鼠肠肌层神经丛的神经元，也影响了肠神经胶质细胞。重要的是，所有这些作用均在体外复制。确切的机制尚不清楚，但有人建议CA和CGA预处理或CGA预处理可以增强神经胶质细胞的活性，从而响应鱼藤酮的暴露而产生抗氧化分子。尽管所使用的CA和CGA剂量可能比喝咖啡的人每天摄入的CA和CGA剂量高2-5倍，但结果显然令人鼓舞。实际上，作者建议，尽管CA和CGA对胃肠蠕动的影响，也许有可能使用一种以食物为基础的有前途的神经保护治疗策略来改善PD的运动症状和非运动症状，例如便秘。在本报告中未作具体评估[224]。在编写此手稿的最后阶段，Rogulja小组发表了一份报告[225]，该报告显示，睡眠的有益效果与肠道健康之间有着关键的联系。他们证明严重的睡眠不足会导致果蝇和小鼠的肠道（而非大脑）中的ROS积累，这与果蝇的死亡有关（睡眠受限的短暂周期无法证明这一点）也在老鼠中）。重要的是，可以通过口服抗氧化剂化合物或通过抗氧化剂酶的肠道靶向转基因表达来预防所有这些作用。许多人使用含咖啡因的咖啡来保持清醒，尽管咖啡因可能有助于失眠[211]，但咖啡的抗氧化剂成分（如褪黑素，这是Rogulja和合作者在上述研究中使用的抗氧化剂之一，[225]）可能会阻止积聚。避免肠道中的ROS，避免自愿睡眠限制的有害作用。4.3.氨基酸及其衍生激素天然存在于咖啡中的化合物之一是色氨酸（Trp），它是饮食中必须提供的必需氨基酸。色氨酸通过钠依赖性中性氨基酸转运蛋白，钠依赖性中性氨基酸转运蛋白（B0AT-1）吸收，需要通过与血管紧张素转化酶2（ACE2）的相互作用来稳定色氨酸[226]。色氨酸的吸收导致分泌α-防御素，富含半胱氨酸的阳离子肽，对多种细菌和其他微生物具有抗生素活性，从而使饮食中的Trp成为肠道菌群稳态所必需的[227,228]。重要的是，Trp的异常吸收（可能是由于慢性应激期间ACE2的细胞表面下调所致[229]或被严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）[230]感染）导致的表现结肠炎，例如腹泻[231]。这种氨基酸对于维生素B3（烟酸）的合成也是必不可少的，这种维生素的缺乏会导致糙皮病，这种疾病的特征在于腹泻，炎症和蛋白质营养不良，并伴有皮肤和中枢神经系统表现[232]。重要的是，最近的研究还表明，烟酸缺乏症可能与阿尔茨海默氏症，帕金森氏症和亨廷顿氏症有关；认知障碍;或精神分裂症[232]。一旦Trp被消化道吸收并从肠道吸收，它就可以在循环中使用（大部分结合白蛋白）并穿过BBB参与CNS中的5-羟色胺合成[233,234]。血清素是一种神经递质，可调节不同的生理方面，例如行为，学习，食欲和葡萄糖稳态[235]。全身5-羟色胺的百分之五是脑源性的[235]，而大多数5-羟色胺（95％）是由胃肠道ECs中的Trp产生的[233]。 EC在胃肠道粘膜中充当感觉转导成分。进食，腔内扩张或传入迷走神经刺激后，EC释放5-羟色胺，其主要靶点是包括迷走神经在内的初级传入神经元的粘膜投射[236]。膳食和外周血清素不能穿过血脑屏障，这意味着与脑源性血清素相比，外周血清素具有不同的功能[235]。外周血清素通过作用于胰腺参与葡萄糖和脂质稳态的调节肝细胞和白色脂肪细胞上的β细胞[235]。血清素也参与内脏疼痛，分泌物的分泌和蠕动反射的调节，并改变在许多不同的精神疾病中也可以检测到这种激素的水平。某些胃肠功能紊乱的症状可能是由于中枢神经系统活性失调，外周水平（肠）失调或通过神经内分泌免疫刺激而两者结合（脑肠轴）引起的。另外，一些研究表明血清素在肝脏中的促纤维化作用，表明它与血小板衍生的生长因子协同作用可刺激肝星状细胞增殖[237]。从大脑中Trp合成的另一种神经递质是褪黑激素[238]。褪黑素在昼夜节律的控制中起着至关重要的作用，它还是一种强大的自由基清除剂和抗氧化剂[239]。咖啡是褪黑激素的来源，但该化合物在人体中的生物利用度较低（约3％）[240]，咖啡因可降低内源性夜间褪黑激素水平[238]，对睡眠时间和睡眠质量有重要影响[211]。 ]。GABA是CNS的主要抑制性神经递质，通常在许多大脑区域中以高浓度存在。在绿色咖啡豆中也可以找到它（表1）。尽管尚不清楚GABA穿过BBB的能力[241]，但其止痛，抗焦虑和降压特性可能是由于对胃肠道受体，循环GABA或一定量的GABA可能通过胃肠道的局部作用所致。 BBB [196,242]。4.4.美拉德反应产物：黑色素膳食纤维和黑色素（后者也称为美拉德化膳食纤维[184]）同样存在于咖啡中（表1），并在肠道甚至大脑中具有促进健康的特性。膳食中的黑色素与纤维相似，可以逃避胃肠道的消化，到达结肠，并成为肠道菌群的底物[243]。在肠道中，膳食纤维会增加粪便体积，有助于正常的肠功能和加速肠道运输[244]。不可消化的碳水化合物被微生物群发酵成SCFA，这些代谢物被归因于几种健康影响[196]。奇怪的是，对雄性Tsumura Suzuki肥胖糖尿病（TSOD）小鼠（一种代谢综合征的公认小鼠模型）进行的研究表明，咖啡因和CGA在每天服用这些化合物16周后，改善了血浆SCFA的分布。但是，在这项研究中，咖啡没有任何作用，可能是因为咖啡成分中的膳食纤维含量因品牌而异[245]。SCFA影响胃肠道上皮细胞的完整性，葡萄糖稳态，脂质代谢，食欲调节和免疫功能，并能够穿过血脑屏障[246]。有趣的是，人类研究报告称，膳食纤维可以从SCGs中分离出来，并具有生时作用[247]，除了可以促进短期食欲和减少能量消耗[248]。此外，最近对14位健康受试者进行的一项随机交叉研究报告说，早餐时食用的咖啡类黑素减少了每日的能量摄入并调节餐后血糖和其他生物标志物[249]。5.结论咖啡是许多化合物的复杂可变混合物，其作用可能根据其来源，加工，生物利用度以及可能的协同和/或拮抗作用而变化。流行病学研究表明，咖啡冲泡可能对消化道产生多种影响，包括对粘膜的抗氧化剂，抗炎和抗增殖作用以及对肌肉层的促运动作用。但是，与其他人体系统和功能（即心血管系统，CNS）已知的形成鲜明对比的是，迄今为止积累的有关咖啡和特定咖啡衍生化合物对胃肠道整体或胃肠道影响的知识尽管胃肠道是第一个与摄入咖啡接触的身体系统，但事实上，整个器官中的不同器官以及对整个肠道壁中不同细胞类型所发挥的特定作用机制都非常缺乏。 。此外，咖啡及其衍生物对脑-肠轴健康（从情绪到神经变性）的影响直到最近才得到解决。咖啡被公认为是全球最受欢迎的饮料之一，也是交易量最大的产品，每天有数百万人消费咖啡[250]。此外，咖啡厂Coffee sp.。提供的功能远远超过传统饮料，其副产品，包括咖啡花，树叶，果肉，果壳，羊皮纸，生咖啡，银皮和SCG，已成为新功能食品的诱人潜在原料来源[251] 。希望，目前对咖啡和咖啡副产品的浓厚兴趣将有助于获得有力的科学证据，以阐明其在胃肠道中促进健康的特性的作用和作用机理。此外，有针对性的功能性食品可能很快就会开发出来，以专门保护或改善胃肠道和脑肠轴的健康。 作者贡献：概念化，R.A .；写作-原始草稿，A.I.-D.，J.A.U.，M.D.d.C.，R.A .；写作-审查和编辑，R.A。和M.D.d.C .；资金获取，R.A。和M.D.d.C.所有作者均已阅读并同意该手稿的发行版本。资金：项目“咖啡行业可持续发展的新知识”由法国国家调查委员会（CSIC）资助（201970E117）； “针对结肠直肠癌患者的风险状况和全球福祉的新成分和有益食品的生产（TERATROPH，IDI-20190960）”和“新型咖啡副产品饮料，可实现脑肠轴的最佳健康（ COFFEE4BGA）”由科学和创新部（PID2019-111510RB-I00）资助。机构审查委员会声明不适用。知情同意声明不适用。数据可用性声明数据共享不适用。致谢感谢YolandaLópez-Tofiño和Gema Vera在记录X射线图像和整个图像时所提供的技术帮助。利益冲突作者宣称没有利益冲突。缩略语[Ca 2+ ] i细胞内游离Ca 2+5-CQA5-O-咖啡酰奎尼酸ACF异常隐窝灶ACE2血管紧张素转换酶2层次分析法超极化后AKTAP丝氨酸/苏氨酸激酶Akt动作电位资料库蛋白激酶BATF-2激活转录因子2ATF-3激活转录因子3B 0 AT-1BBB钠依赖性中性氨基酸转运蛋白血脑屏障是巴雷特食管认证机构咖啡酸钙2+cAMP环磷酸腺苷单磷酸钙大车可卡因和苯丙胺调节的转录本注册会计师绿原酸CGRP降钙素基因相关肽国际会议钙诱导的钙释放中枢神经系统中枢神经系统COX-2环氧合酶2品质保证咖啡酰奎尼酸CRC大肠癌C反应蛋白C反应蛋白工商管理硕士二甲基苯并蒽DSS葡聚糖硫酸钠欧共体肠嗜铬细胞EGFENS表皮生长因子肠神经系统ERKf-EPSP细胞外信号调节激酶，快速兴奋，突触后电位加巴γ-氨基丁酸格尔德胃食管反流病GSK3βGST糖原合酶激酶3β谷胱甘肽S-转移酶他苏木精/曙红HIF-1缺氧诱导因子1HO-1血红素加氧酶-1HSP 70IARC热休克蛋白70国际癌症研究机构IBD炎症性肠病国际刑事法院卡哈尔间质细胞IKKIkB激酶白介素白介素iNOS诱导型一氧化氮合酶JNKMAPKMcl-1MCP-1c-Jun N-末端激酶促分裂原活化蛋白激酶髓样细胞白血病1甲基接受趋化蛋白-1SAPK应激激活蛋白激酶梅克·明格MAPK / ERK激酶N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍MP肠神经丛ND没有检测到核因子-kβ核因子-kβ氮氧化物一氧化氮合酶没有一氧化氮NR没有报告PAI-1纤溶酶原激活物抑制剂1局部放电帕金森氏病PTENPG磷酸酶和张力蛋白同源前列腺素PhIP2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5- b ]吡啶ROS活性氧RP静息潜力RyRryanodine受体层次分析法超极化缓慢SARS-CoV-2严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2美国足协短链脂肪酸SCG用过的咖啡渣EPS缓慢的兴奋性突触后电位SMP粘膜下丛SPP物质spp。STAT5TNF-R物种信号转导子和转录激活子5肿瘤坏死因子受体坏死因子肿瘤坏死因子TOPK色氨酸淋巴因子激活的杀手t细胞起源的蛋白激酶样蛋白色氨酸UDPUGT1A尿苷二磷酸UDP葡萄糖醛酸转移酶VACHT水泡乙酰胆碱转运蛋白血管内皮生长因子血管内皮生长因子贵宾血管活性肠肽WHO世界卫生组织ZO-1zonulin-1参考文献（可至原文查看）1. 鲁米斯，D。 K.Z. Guyton;格罗斯（Y.劳比-塞克雷坦（B.） El Ghissassi，F。 V. Bouvard；本布拉欣-塔拉（L. N.古哈；马托克，H。 Straif，K.饮用咖啡，伴侣和非常热的饮料的致癌性。柳叶刀·Oncol。 2016，17，877–878。 [CrossRef]2. 格罗索（Grosso）戈多斯，J。 Galvano，F.；Giovannucci，E.L.咖啡，咖啡因和健康结果：《雨伞评论》。年。版本号营养食品2017，37，131–156。 [CrossRef][PubMed]点击：查看咖啡及其成分对胃肠道和脑肠轴的影响（上） 查看更多医学文章 试用免费翻译功能免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网站无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。来源于：mdpi

人类冠状病毒：病毒与宿主相互作用的综述（上）与TLR不同，RLR和NLR普遍存在。 RLR是一个胞质受体家族，由三个成员组成：视黄酸诱导基因I（RIG-1），黑素瘤分化相关因子5（MDA5）和遗传与生理学实验室2（LGP2）。 RIG-1和MDA5在其N端具有两个胱天蛋白酶招募域（CARD），一个DExD / H-box RNA解旋酶域（其中x可以是任何氨基酸）和一个在C端的阻遏域（RD）。另一方面，LGP2缺少CARD域[112]，并且它可以调节RIG-I和MDA5。积极或消极[113–115]。 RIG-I识别病毒基因组中存在的51-三磷酸部分RNA，以及通过病毒基因组互补末端的自退火形成的双链“panhandle”结构[116,117]。相反，MDA5通常会检测到更长的dsRNA序列。 RIG-1和MDA5与病毒RNA的结合会导致构象变化，从而暴露CARD域。募集了一种定位于线粒体和过氧化物酶体的衔接子蛋白，称为线粒体抗病毒信号转导适配器，MAVS。然后，MAVS激活转录因子，例如干扰素调节因子1（IRF1），IRF3和NF-κB，以触发干扰素（IFN）和促炎性细胞因子

人类冠状病毒：病毒与宿主相互作用的综述Yvonne X in一l IM, y按L ing ng, James P. ta们and ding X Ian GL IU *南洋理工大学生物科学学院，南洋大道60号，新加坡637551；新加坡； YVON0016@e.ntu.edu.sg（Y.X.L.）; S150004@e.ntu.edu.sg（Y.L.N.）; JPTAM@ntu.edu.sg（J.P.T.）收到：2016年6月8日;接受：2016年7月18日；发布时间：2016年7月25日摘要：人类冠状病毒（HCoV）是已知的与一系列呼吸结果相关的呼吸道病原体。在过去的14年中，重度急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的发作使HCoV在人类中具有很高的致病性，已成为研究界的关注焦点。HCoV-宿主相互作用的研究为我们对HCoV发病机理的理解做出了广泛贡献。在这篇综述中，我们讨论了宿主细胞因子的最新发现，这些因子可能被HCoV利用以促进其自身的复制周期。我们还讨论了各种细胞过程，例如细胞凋亡，先天免疫，内质网应激反应，有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径和可能由HCoV调节的核因子κB（NF-κB）途径。 关键词：人冠状病毒；病毒与宿主的相互作用；细胞凋亡先天免疫；内质网应激MAPK；核因子κB 1. 介绍人冠状病毒（HCoV）代表与严重性不同的多种呼吸系统疾病相关的主要冠状病毒（CoV），包括普通感冒，肺炎和支气管炎[1]。如今，由于HCoV具有高的基因组核苷酸取代率和重组能力，因此被公认为发展最快的病毒之一[2]。近年来，HCoV的进化也受到诸如城市化和家禽养殖等因素的推动。这些已允许物种的频繁混合，并促进了这些病毒的物种屏障和基因组重组的穿越[3]。迄今为止，已鉴定出六种已知的HCoV，即HCoV-229E，HCoV-NL63，HCoV-OC43，HCoV-HKU1，严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）；其中，四种HCoV（HCoV-229E，HCoV-NL63，HCoV-OC43和HCoV-HKU1）在全球范围内流通，约占人类普通感冒感染的三分之一[4]。在严重的情况下，这四种HCoV可以引起危及生命的肺炎和细支气管炎，特别是在老年人，儿童和免疫功能低下的患者中[1,5,6]。除呼吸系统疾病外，它们还可能引起肠道和神经系统疾病[7-11]。SARS-CoV最初于2002-2003年在中国广东出现，是一种典型的非典型肺炎，其特征是发烧，头痛以及随后出现的咳嗽和肺炎等呼吸道症状，后来可能发展为危及生命的呼吸衰竭和急性呼吸窘迫综合征[ 12]。它在人类中具有很高的传播性，并迅速传播到29个国家/地区，感染了8000多人，死亡率约为10％[13,14]。最初，棕榈果被认为是病毒的天然贮藏库[15]。但是，随后的系统发育研究指出，SARS-CoV的蝙蝠起源是基于蝙蝠中发现的SARS样病毒序列[16]。 2012年，沙特阿拉伯出现了MERS-CoV流行病，其临床症状与SARS-CoV类似，但是死亡率要高得多，约为35％[17]。与表现出超级传播事件的SARS-CoV不同，MERS-CoV的传播受地域限制[12]。实际上，报告的MERS-CoV病例通常源于中东国家内的暴发或近期到该地区的旅行[18,19]。分类学，基因组结构和形态CoV是冠状病毒科下的一组大型包膜RNA病毒。冠状病毒科与Artierivirdae和Roniviridae一起归类于Nidovirale顺序[20]。根据国际病毒分类学委员会的建议，基于整个病毒基因组的序列比较，冠状病毒进一步分为四个主要属，α-，β-，γ-和三角冠状病毒[21,22]。这些冠状病毒可感染多种宿主，包括禽，猪和人类。已鉴定出HCoV属于Alpha或Beta冠状病毒属，包括Alphacoronaviruses，HCoV-229E和HCoV-NL63以及Betacoronaviruses，HCoV-HKU1，SARS-CoV，MERS-CoV和HCoV-OC43（表1）。在电子显微镜下，冠状病毒病毒颗粒看起来大致呈球形或中等多形性，由刺突蛋白（S）形成独特的“棍状”突起[23,24]。在病毒体内部有一个螺旋对称的核衣壳，它包裹着一个巨大的单链和正向RNA病毒基因组，其大小约为26至32千个碱基[20]。正性病毒基因组RNA充当信使RNA（mRNA），包括51个末端帽结构和31个poly A尾巴。这种基因组RNA在病毒生命周期中具有三种功能：（1）作为感染周期的初始RNA； （2）作为复制和转录的模板； （3）作为包装入子代病毒的底物。复制酶-转录酶是唯一从基因组翻译的蛋白质，而所有下游开放阅读框的病毒产物均来自亚基因组mRNA。在所有冠状病毒中，复制酶基因约占基因组的51分之三，由两个重叠的开放阅读框（ORF），ORF1a和ORF1b组成，它们编码16个非结构蛋白。 CoV基因组RNA的最后三分之一编码四个结构蛋白基因的CoV规范集，顺序为尖峰（S），包膜（E），膜（M）和核衣壳（N）。此外，还沿着结构蛋白基因散布了一些辅助ORF。CoV物种的数量和位置各不相同[25]（图1）。图1.人类冠状病毒（HCoV）的基因组组织。 HCoV基因组的大小范围约为26至32千个碱基（kb），如刻度上方的黑线所示。冠状病毒（CoV）基因组通常按51-ORF1a-ORF1b-S-E-M-N-31的顺序排列。重叠的开放阅读框（ORF）ORF1a和ORF1b占冠状病毒基因组的三分之二，该基因组编码了病毒RNA合成所需的所有病毒成分。基因组31末端的另外三分之一编码一组结构蛋白（橙色）和非结构蛋白（绿色）。表1.人冠状病毒的分类。冠状病毒科 菌株发现细胞受体主办参考文献冠状病毒HCoV-229E 1966人氨基肽酶N（CD13）蝙蝠[1,2,21]肝炎病毒-NL632004ACE2棕榈果，蝙蝠[3,21]冠状病毒OC4319679-O-乙酰化唾液酸牛[4,5]β冠状病毒HcoV-HKU1 20059-O-乙酰化唾液酸老鼠[6,7]SARS冠状病毒2003ACE2棕榈果，蝙蝠[8,19,21]冠状病毒2012DPP4蝙蝠，骆驼[9] 2. 宿主因素参与病毒复制和发病机理作为细胞内专性寄生虫，HCoV利用宿主细胞机制进行自身复制和传播。由于病毒与宿主之间的相互作用是疾病的基础，因此有关其相互作用的知识引起了极大的研究兴趣。在这里，我们描述了细胞在冠状病毒感染周期中的作用的已知情况：附着；进入宿主细胞；复制酶-转录酶的翻译；基因组复制和mRNA转录；新包装的病毒体的组装和萌芽（图2）。图2.冠状病毒复制周期。冠状病毒感染始于刺突蛋白（S）的S1结构域与其同源受体的附着。这驱动了S中S2亚基的构象变化，促进了病毒和细胞质膜的融合。核衣壳释放到细胞质后，病毒gRNA通过核糖体移码翻译产生多蛋白pp1a和pp1ab。 pp1a和pp1ab由宿主和病毒蛋白酶进行蛋白水解处理，生成16个非结构蛋白（NSP），然后将其组装形成复制酶-聚合酶。复制酶-聚合酶参与冠状病毒的复制，在该过程中基因组RNA被复制，亚基因组RNA被转录并翻译以形成结构蛋白。产生的病毒产物将在ERGIC中组装，并以光滑壁囊泡的形式发芽到质膜，通过胞吐作用排出。促进感染和抑制感染的宿主因子分别以绿色和红色突出显示。 APN，氨肽酶N； ACE2，血管紧张素转化酶2； DPP4，二肽基肽酶4； 9-O-Ac唾液酸，9-O-乙酰化唾液酸; IFITM，干扰素诱导的跨膜蛋白； ATP1A1，ATPase，Na + / K +转运，α1多肽; HnRNP A1，异核核糖核蛋白A1； MADP1，锌指CCHC型和RNA结合基序1； DDX1，ATP依赖性RNA解旋酶； PCBP1 / 2，Poly r（C）结合蛋白1/2;PABP，Poly A结合蛋白；COPB2，Coatomer蛋白复合物，β2亚基（β素）； GAPDH，甘油醛3-磷酸脱氢酶； ERGIC，内质网高尔基体中间隔间；ER，内质网；VCP，含缬氨酸的蛋白。 2.1. 冠状病毒附着和进入CoV感染是通过刺突（S）蛋白附着于特定宿主细胞受体而引发的。宿主受体是病毒的致病性，组织嗜性和宿主范围的主要决定因素。 S蛋白包含两个结构域：S1和S2。 S1结构域及其同源受体之间的相互作用触发S蛋白的构象变化，然后通过S2结构域促进病毒和细胞膜之间的膜融合。今天，所有HCoV使用的主要宿主细胞受体是已知的：HCoV-229E产生的氨肽酶N[26]，SARS-CoV产生的血管紧张素转换酶2（ACE2）[27]和HCoV-NL63[28,29]，二肽MERS-CoV的肽酶4（DPP4）[30]和HCoV-OC43和HCoV-HKU1的9-O-乙酰化唾液酸[31,32]。除了常规的内体进入途径外，某些冠状病毒也可能进入通过非内体途径，或两者结合的细胞。细胞环境中的低pH值和内体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶可能有助于促进膜融合和内体CoV细胞进入[33]。最近的证据支持组织蛋白酶L在SARS-CoV和MERS-CoV进入中的作用[34-36]。其他宿主蛋白酶，例如跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）和气道胰蛋白酶样蛋白酶TMPRSS11D，也可以在HCoV-229E和SARS期间进行S1 /S2裂解以激活S蛋白，使非蛋白体病毒进入细胞质膜。 -CoV感染[37,38]。此外，MERS-CoV也被弗林蛋白酶激活，弗林蛋白酶是一种丝氨酸内肽酶，已与其他RNA病毒的细胞进入和病毒流出过程中的S1/ S2裂解有关[39]。许多宿主细胞还利用其自身的因素来限制病毒的进入。利用细胞培养系统和假型病毒，许多研究小组确定了干扰素诱导型跨膜蛋白（IFITM）家族，它们可以抑制全局循环的HCoV-229E和HCoV-NL63 S蛋白介导的进入，以及高致病性的SARS-CoV和MERS -CoV [12,40]。尽管IFITM的作用方式仍然难以捉摸，但一些研究小组进行的细胞间融合试验表明，IFITM3通过调节宿主膜的流动性来防止病毒包膜与质膜或内体膜融合，从而阻止了包膜病毒的进入[ 41]。2.2. 冠状病毒复制在病毒核衣壳释放并脱去细胞质后，CoV复制开始于将ORF 1a和1b翻译成多蛋白pp1a（4382个氨基酸）和pp1ab（7073个氨基酸）。在这里，下游的ORF1b通过核糖体移码机制进行翻译，在这种机制中，翻译的核糖体沿´1方向从ORF1a阅读框转移到ORF1b阅读框。通过两个RNA元件（51-UUUAAAC-31七核苷酸滑序列和RNA假结结构）可以实现重新定位。随后，将多蛋白pp1a和pp1ab切割成至少15 nsp，它们组装并形成复制转录复合体。通过复制酶聚合酶的组装，转录基因组RNA的全长正链，形成全长负链模板，用于合成新的基因组RNA和重叠的亚基因组负链模板。然后将这些亚基因组mRNA转录并翻译以产生结构蛋白和辅助蛋白。已经发现几个异源核糖核蛋白（hnRNA）家族成员（hnRNPA1，PTB，SYN-CRYP）对于有效的RNA复制是必不可少的[42]。还建议其他RNA结合蛋白在冠状病毒复制中发挥作用，例如间-α固醇酶和聚A结合蛋白（PABP），DDX1，PCBP1 / 2和锌指CCHC型和RNA结合基序1 （MADP1）[43-45]。2.3. 冠状病毒组装和出口随着新基因组RNA和结构组分的积累，病毒体的组装很快得以实现。在感染周期的这个阶段，含有基因组RNA的螺旋核衣壳与其他病毒结构蛋白（S，E和M蛋白）相互作用形成组装的病毒体。 CoV颗粒的组装是通过从内质网到高尔基体的分泌途径中早期的膜状螺旋核衣壳出芽而完成的。中间隔层（ERGIC）。很少探讨宿主在感染周期此阶段的贡献。目前，已知M蛋白通过在组装位点选择和组织病毒包膜成分并介导与核衣壳的相互作用来使病毒粒子出芽来协调整个组装过程[46]。M蛋白与不同的病毒结构蛋白（例如E蛋白）相互作用，组装成成熟病毒。这种相互作用产生了病毒粒子包膜的支架，并诱导了M蛋白修饰的膜以及与S蛋白的萌芽和释放，从而将刺突组装到病毒包膜中[46,47]。组装和出芽后，病毒粒子在囊泡中运输，并最终通过胞吐作用释放。在最近的一项研究中，抑制含缬氨酸的蛋白质（VCP / p97）导致病毒在感染性支气管炎病毒（IBV）的早期内体中蓄积，表明VCP在负载病毒的内体成熟中发挥了作用[48]。3. 人冠状病毒感染和凋亡凋亡是程序性细胞死亡的过程，其受到严格调节和消炎。当细胞发生凋亡时，它们表现出特定的标志，例如细胞萎缩，广泛的质膜起泡，核变性，DNA断裂和质膜的不对称分布[49-51]。迄今为止，已经建立了两种主要的细胞凋亡机制-外在途径和内在途径。外在途径是通过细胞外死亡配体（例如Fas配体（FasL）和TNF受体相关的凋亡诱导配体（TRAIL））与来自肿瘤坏死因子（TNF）超家族的死亡受体的结合而启动的[52] ]。然后，这些死亡受体募集各种死亡衔接蛋白，例如Fas相关的死亡结构域蛋白（FADD）[53]，以及启动子蛋白酶8和10形成诱导死亡的信号复合物（DISC）[54,55]。因此，两个启动子原蛋白酶被切割成其活性形式并诱导信号传导级联，最终激活效应子胱天蛋白酶3和7。另一方面，内在途径在细胞内部发生，并涉及线粒体外膜通透性（MOMP）的变化。 ）基于促凋亡和抗凋亡B细胞淋巴瘤2（Bcl2）家族蛋白质的比率（图3）。增强的MOMP会导致促凋亡因子（例如细胞色素c）的释放，从而激活启动子胱天蛋白酶9。像外在途径一样，内在途径中的启动子胱天蛋白酶9的激活会导致蛋白水解裂解效应子胱天蛋白酶3和7，进而分解许多蛋白酶。凋亡必不可少的关键细胞蛋白[56]。当Bid（一种促凋亡的Bcl2家族蛋白）直接被caspase 8裂解时，甚至在效应子caspase激活之前，两条途径之间的融合也可能发生。在病毒感染期间，凋亡被诱导为宿主抗病毒反应之一，以限制病毒复制和生产。许多病毒已经进化出不同的策略来破坏细胞凋亡[58]。例如，某些病毒编码充当Bcl2家族蛋白同源物的病毒蛋白[59]。另外，病毒可能会通过其他分子途径，例如有丝分裂原活化蛋白（MAPK）和核因子κB（NF-κB）途径，直接或间接地建立调节Bcl2家族蛋白或半胱天冬酶激活的机制[60-65]。有趣的是，某些病毒可能会参与凋亡机制以进行有效的病毒感染。例如，甲病毒和黄病毒含有富含磷脂酰丝氨酸的病毒膜，以模仿凋亡细胞以促进病毒进入[66]。3.1. 细胞趋向与凋亡由于HCoV是已知可感染源自呼吸道的组织培养物和细胞系的呼吸道病原体，因此这些病毒也可能感染其他组织培养物和细胞系。这些组织和细胞的感染可能会诱导细胞凋亡[67,68]。然而，尽管HCoV在感染期间主要靶向呼吸道，但它们还与多种细胞类型的凋亡诱导相关，包括肠道粘膜细胞，肾小管细胞和神经元细胞[69-74]。对SARS-CoV感染组织的尸检研究表明，在肺，脾和甲状腺中诱导了细胞凋亡[75]。还显示出HCoV会感染免疫系统并诱导免疫细胞（例如巨噬细胞，单核细胞，T淋巴细胞和树突状细胞）凋亡[69,76-79]。因为这些免疫细胞与先天性和获得性免疫的激活有关，有理由推测，大量消除这些细胞可能是抑制宿主先天性和适应性免疫反应的一种病毒策略。在最近的研究中，据报道HCoV-229E感染导致大量CPE和树突状细胞死亡[80]。由于树突状细胞遍布我们的整个身体，因此有可能将它们用作促进病毒传播和损害我们的免疫系统的媒介[80,81]。 图3. Bcl2蛋白家族对MOMP的调节。 （a）Bcl2蛋白质家族根据其功能和Bcl2同源性（BH）结构域的数量分为三大类。生存前的Bcl2样家族成员（Bcl2，B细胞超大淋巴瘤（Bcl-XL），骨髓细胞白血病（Mcl1））包含所有四个BH结构域，并且具有抗凋亡作用。第二类称为Bcl2相关X（BAX）样蛋白，包括BAX和Bcl2同源拮抗剂杀手（BAK），具有促凋亡作用，并且缺少BH4结构域。最后，第三类称为仅BH3蛋白（Bid，与Bcl2相关的死亡启动子（Bad）和p53上调的细胞凋亡调节剂（PUMA）），仅包含BH3结构域，并且具有促凋亡作用。 （b）提出了两种模型来解释Bcl2家族蛋白在MOMP中的作用-间接激活剂模型和直接激活剂-抑制剂模型[11]。在间接激活剂模型中，抗凋亡的Bcl2样蛋白抑制Bax-Bak孔复合物插入线粒体，从而促进MOMP和细胞色素c的释放。但是，当仅BH3的蛋白被激活超过某个阈值时，Bcl2样蛋白的抑制作用就会被破坏。在直接激活物-抑制剂模型中，仅BH3蛋白充当直接激活物，以诱导Bak-Bak插入线粒体外膜。这些仅BH3的蛋白质可以被类Bcl2的蛋白质抑制，而后者又可以被另一类仅BH3的蛋白质抑制。该图是对[12]的修改。3.2. 细胞凋亡的分子机制在分子水平上，据报道，HCoV感染可通过多种机制触发细胞凋亡。SARS-CoV诱导的凋亡显示为caspase依赖性的，并可能被caspase抑制剂Z-VAD-FMK或Bcl2的过表达抑制[82,83]。尽管病毒复制是诱导细胞凋亡所必需的[83]，但细胞凋亡并不影响SARS-CoV的病毒复制动力学[82]。另一方面，MERS-CoV感染原代T淋巴细胞可诱导DNA片段化并激活caspase8和9激活，表明外部和内部途径均被激活。与SARS-CoV感染不同，MERS-CoV复制对于诱导受感染的T淋巴细胞凋亡不是必需的[79]。病原性较低的细胞也可以诱导细胞凋亡芯片数据证实，HCoVs菌株在HCoV-229E感染期间Bcl2家族成员的促凋亡和抗凋亡基因表达发生了显着变化[84]。 HCoV-OC43的感染可促进人神经元细胞中BAX易位至线粒体[74]。尽管胱天蛋白酶3和9在感染HCoV-OC43的鼠和人神经元细胞中被激活[9,74]，但添加泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK和半胱天冬酶9抑制剂Z-LEHD-FMK不会影响这些感染的神经元细胞的活力，表明由HCoV-OC43诱导的程序性细胞死亡可能与胱天蛋白酶无关[74]。这突出了在HCoV感染中诱导非经典程序性细胞死亡机制的可能性。尽管在SARS-CoV中仅对此进行了研究，但HCoV感染过程中的凋亡机制很可能受病毒蛋白操纵（图4）。特别是，SARS-CoV S，N，E，M，ORF-6、7a和9b蛋白已显示在其宿主细胞中具有促凋亡功能[77,85-91]。 SARS-CoV E蛋白和7a蛋白的表达通过将抗凋亡的Bcl-XL蛋白螯合到内质网（ER）膜而促进了线粒体介导的细胞凋亡[77,92]。 SARS-CoV M蛋白也高度促凋亡，并介导半胱天冬酶8和9的激活[90]。此外，已显示HCoV-OC43野生型S蛋白在人神经元NT2-N和LA-N-5细胞系中诱导未折叠的蛋白应答（UPR），这可能导致细胞凋亡[93]。重组HCoV-OC43在其S蛋白处具有点突变，比野生型病毒诱导的caspase 3活化和核碎裂作用更强[93]。有趣的是，SARS-CoV N和9b蛋白的定位与caspase依赖性细胞凋亡的诱导有关[89,94]。这一发现为病毒蛋白的亚细胞定位和胱天蛋白酶激活之间的联系开辟了新的视角，而胱天蛋白酶激活是由HCoV调节细胞凋亡的一种方式。图4. HCoVs激活细胞凋亡。死亡配体与死亡受体的结合诱导胱天蛋白酶8激活，继而激活效应子胱天蛋白酶3和7以刺激细胞凋亡。另一方面，内在途径受促凋亡和抗凋亡的Bcl2家族蛋白（如Bcl-XL，Bcl2，Bax和Bak）调控，以诱导MOMP。随后由增强型MOMP引起的caspase 9激活刺激了caspase 3和7激活。在HCoV感染过程中，病毒或特定病毒蛋白（橙黄色方框）靶向外部和固有凋亡信号通路的多个阶段。4. 人冠状病毒感染和先天免疫当细胞暴露于病原体（如病毒）时，免疫应答以宿主防御的形式被诱导。在病原体暴露期间，以细胞类型依赖性方式调节免疫应答。在产生适应性免疫系统之前，先天免疫是抵御病毒的第一道防线。宿主和病毒都可以操纵先天免疫机制作为防御或逃避策略的一种形式[95,96]。 4.1. 模式识别受体免疫系统中的细胞通过几种识别策略来检测病毒病原体。其中，特征最清楚的是模式识别受体（PRR），其通过称为病原体相关分子模式（PAMPs）的进化保守结构与各种微生物病原体结合。 PRR主要分为三类，即Toll样受体（TLR），视黄酸诱导型基因I（RIG-1）样受体（RLR）和核苷酸寡聚化域（NOD）样受体（NLR）。TLR是一种I型跨膜蛋白，位于细胞表面或内体囊泡中。它们的富含亮氨酸的重复序列（LRR）域介导了对PAMP的识别以及来自细菌，真菌和病毒等各种来源的损伤相关分子模式（DAMP）[97]。 TLR的激活主要发生在抗原呈递细胞中，例如树突状细胞（DC），巨噬细胞，单核细胞和B细胞。在人类的10种已知TLR中，发现TLR2、3、4、7和9与病毒检测有关[98,99]。 TLR3识别双链RNA（dsRNA），这是病毒RNA复制过程中产生的复制中间体[100]。TLR7和8检测单链RNA（ssRNA），TLR9识别DNA病毒中存在的未甲基化CpG DNA [101-103]。除核酸外，其他TLR（例如TLR2和4）还可以检测到病毒蛋白，例如呼吸道合胞病毒（RSV），肝炎病毒，麻疹病毒和人类免疫缺陷病毒[104-107]。识别病毒成分后，TLR募集含有Toll /白介素1受体（TIR）的信号转接头分子，例如MyD88（髓样分化主要反应蛋白88）和含有TIR域的衔接子诱导干扰素-β（TRIF）[108–110]。然后，MyD88和TRIF刺激MAPK和NF-κB途径，以增强IFN和促炎性细胞因子的产生[111]。点击：病毒与宿主相互作用的综述（中） 查看更多医学文章 使用双语翻译功能免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网站无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。来源于：mdpi

切口深度比对钢纤维混凝土开裂后行为的影响(上）从实验中获得的接近平均法向应力的特征残余应力的评估要求测试之间的分散度较低。这可以通过增加样本数来实现。这将导致统计不确定性因子kx减小，因此结果的变化将较小。在表4中，示出了两个系列的残余强度的分类。根据模型代码2010（MC-2010）[44,45]的建议，对于分类，分别对五个和六个样本进行了测试，系数kxn = 2.33和2.18。没有分类的（a/d）比是没有达到最小特征残余强度1N /mm2的比。对于系列1的比率（a/ d）= 0和0.08所获得的结果低而不足，不足以达到最小特征残余应力并能够对其残余行为进行分类。相反，比率（a / d）= 0.16和0.33在它们各自的残余响应中显示出完美的塑性行为和硬化行为。图10. 每个（a / d）比的特征残余强度：（a）系列1和（b）系列2。如表4所示，系列2的结果表明，通过增加（a/d）比率，也会在残余阶段提高性能，这可能会导致硬化行为，如表4所示。 （a/ d）= 0.33比率。这证明了纤维含量足够高，可以在弯曲下表现出硬化行为[50]。这表明，即使通过增加比率（a /d）减小到达第一裂纹的峰值载荷，通过改善残余阶段的性能，纤维的添加也可以达到甚至超过这种载荷。该行为将不取决于破裂表面上的总纤维量，而是取决于对水泥基体的破裂过程的控制有有效贡献的纤维量。4.5. 钢纤维混凝土的断裂能如表5所示，系列1的（a / d）比的增加对断裂能产生不利影响，如用断裂功模型1计算的那样。这表明具有纤维的增强基体无能为力。阻止裂纹扩展；这与系列2中观察到的相反，在系列2中，通过使用大量的纤维（即40 kg / m3），即使（a / d）比增加，断裂能也会增加。这种行为意味着，由于存在大量的纤维，通过整个裂纹面的应力的桥接机制，裂纹强度会增加，这会在基体中产生多重裂纹条件。表5. 用模型1 [ 47 ]计算的用纤维增强的样品（系列1和系列2）的断裂能。这样，由于钢的提取过程，裂化后阶段获得的断裂能将受到位于水泥基体中的纤维量以及残余阶段中传递应力的能力的影响。纤维由于其钩状端的拉直而产生较高的能量消耗。通过限制裂纹的扩展以及限制裂纹的发生，它们也具有减小裂纹上部应力集中的能力[36,37,51-57]。如前所述，在比率（a / d）= 0.08和0.33的情况下，考虑到系列2的断裂能的平均增量超过100％，断裂能表示纤维在残余阶段的重要贡献。 ，相对于系列1获得的结果。对于比率（a / d）= 0，相差仅为57％；对于这表明样品中没有缺口将无法使纤维有效发挥作用，从而限制了能量断裂的增加。图11a，b显示了用于斜率裂缝工作模型（模型2）的剩余阶段裂缝能量计算的图表。在这些图中，代表了每组测试样品以及韧带的初始大小（样品顶面和缺口尖端之间的面积）。考虑到断裂功与开裂表面成比例，并且开裂的最终面积等于韧带的初始面积[48]。图11.用斜率断裂功模型2计算断裂能的曲线拟合：（a）系列1和（b）系列2。在这些图中，对于缺口从上到下的裂隙梁，认为零能量的必要性。这意味着假定曲线从原点开始。此外，曲线的斜率表示裂纹扩展一个深度单元所消耗的能量。通过将该斜率除以梁的宽度（b），可以得出所需的断裂能。值得一提的是，通过该模型获得的断裂能结果与第一个模型获得的结果相对接近。这些值在表6中表示，其中GF（1）和GF（2）分别代表从模型1和2计算得到的断裂能。表6.通过研究模型计算的断裂能（GF）[58]。可以看出，第二个模型与结果的变化有直接关系，因为通过获得高变化系数，因子R2也将增加。这可能导致难以获得复合材料的后裂化阶段行为的代表性结果。5.结论本文介绍的结果仅限于具有钢纤维的纤维增强混凝土，并且已描述了体积纤维的百分比。因此，需要使用其他类型的纤维（合成纤维和天然纤维）并具有不同的特性进行实验，以扩大改善混凝土开裂后响应的机会范围。根据结果，可以得出以下结论：1. 假设在每个研究系列中获得的载荷值都是封闭的，则比例极限下的载荷不受钢纤维添加的影响。这表明，在此阶段，材料的性能主要取决于水泥基质和剩余的混凝土面积。2. 荷载和应力在比例极限处表现出与缺口深度比成反比的行为，这种比例的增加将导致混凝土易于失效。3. 纤维剂量的增加导致法向和特征残余应力的改善。4. 对于系列2，切口深度比（a / d）的增加会增强法向和特征残余性能。对于比率（a / d）= 0，法向残余应力的增量为61％，而对于比率（a / d）= 0.08、0.16和0.33，增量为157％，129％和86 ％， 分别。比值（a / d）= 0.08提供了所有考虑的比值中最佳的特征残留性能。5. 对于系列1，切口深度为25毫米，等于（a / d）的比值为0.16，是满足国际标准中规定的最小残余应力要求的唯一比率。6. 对于少量的纤维（在这种情况下为20 kg / m 3）和小的（a / d）比（即a / d <0.16），由于残留强度的最小分类是不可能的，这是由于样本无法达到最小值的事实。7. （a / d）= 0.33可以得到更大的残余强度分类，这意味着开裂后的性能不取决于混凝土，而是取决于纤维传递应力的能力。试样的裂纹面以及位于分析区域的纤维数量。8. 通过将纤维体积从20 kg / m 3增加到40 kg / m 3，断裂能增加了约97％（模型1）和约35％（模型2）。这意味着钢纤维有助于改善复合材料的残余性能。9. 对于系列2，即使（a / d）比也增加，断裂能也会增加。大量纤维的存在使抗裂强度增加，并在基质中产生多重裂化条件。10. 所使用的数学模型显示出相似的结果，尤其是对于混凝土中钢纤维含量高的情况。11. 相对于标准中推荐的比率，本研究中获得的结果将为不同比率（a / d）提供实验参考框架，这可以有助于对从实验室测试确定的残余应力进行分析的标准。参考文献1. 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切口深度比对钢纤维混凝土开裂后行为的影响 通过：何塞·瓦尔迪兹·阿吉拉尔，塞萨尔·华雷斯·阿尔瓦拉多 ，何塞·M·门多萨·朗格尔和贝尔纳多·T·泰兰·托雷斯收到：2020年12月13日/修订：2021年1月5日/接受：2021年1月8日/发布：2021年1月18日 摘要：混凝土几乎没有抗拉强度，易开裂，导致使用寿命降低。因此，重要的是找到有助于减轻这些缺点的互补材料。这项研究的目的是通过研究四种缺口深度比0、0.08、0.16，通过分析和实验方法确定添加钢纤维对开裂后阶段纤维增强混凝土性能的影响。和0.33。使用普通混凝土（对照）和体积纤维分别为0.25％和0.50％的纤维增强混凝土，通过72次弯曲测试进行了评估。结果表明，缺口与深度之比最高为0.33的样品能够实现硬化行为。研究结果表明，即使还增加了切口深度比，剂量的增加也会导致残余性能的提高。关键词： 钢纤维增强的混凝土; 钩端钢纤维; 后开裂行为; 切口深度比；延性; 韧性; 断裂能1. 介绍由于其多功能性，可成型性以及其成分的广泛可用性，混凝土是世界上使用最广泛的建筑材料[1-3]。但是，混凝土几乎没有抗拉强度，容易开裂，导致使用寿命降低，因为一旦开裂开始，混凝土就缺乏机械强度，突然失效[4-8]。因此，材料科学和混凝土技术一直在努力寻找一种可以减轻这些缺点的补充材料，一旦达到初次裂纹负荷，就可以提供防止完全断裂的能力。换句话说，他们正在努力寻找一种有助于改善应变容量和能量吸收的材料。这些材料之一是钢纤维。几项有关钢纤维的研究证明，混凝土的抗压强度仅有最小的提高[9-13]。但是，在抗拉强度测试[14-16]上已对性能产生了很大的影响，而在冲击载荷和残余强度测试上则更显着[17-20]。钢纤维适合于增强混凝土，因为它们提供了能量消散机制，并且比普通混凝土更有效地控制了残余阶段的裂纹扩展。后者是使用这种增强材料的主要优点之一。但是，由于有效的混凝土面积，其他特性也会受到影响，例如，纤维的残余性能，这是应力通过纤维与水泥基体之间形成的键传递的主要因素之一[21]。 残余性能的研究可以通过带有受控裂纹的缺口试样来进行，从中获得代表性数据，并且其分散系数小于未缺口试样的分散系数[22,23]。据报道，使用钢纤维增强混凝土（SFRC）有几个优势，例如，降低成本和改善结构质量，主要是在裂缝控制和循环荷载下[24]。一些作者集中研究了埋入普通混凝土和钢纤维增强混凝土纽带中的钢筋的拉伸刚度效应，改变了主要参数，例如纤维体积，最大骨料尺寸和钢筋直径，观察钢纤维混凝土在控制钢筋混凝土结构裂缝模式中的有效性[25]。另一方面，据报道，随着钢纤维的加入，弯曲裂纹的宽度明显减小，而随着钢纤维的加入，第一裂纹载荷和最大载荷也增加了[26]。其他对其他类型纤维的研究，即聚丙烯纤维（PFRC），发现断裂能较高，这是因为PFRC裂解后性能与纤维分布和取向之间有很强的依赖性[27]。关于表征纤维增强混凝土的弯曲试验，发现试样的破坏模式受其跨深比的影响。这意味着它的失效模式是由剪切或弯曲控制的[28]。对于残余强度评估，国际规范和标准已建议对中跨槽口的梁试样进行三点弯曲试验，以通过将槽口深度比（即a /d）确定为0.16 [20]来控制裂纹的发展。 ]。在这项研究中，通过添加两种剂量的钢纤维，一种20 kg / m3（0.25％）（系列1），另一种40倍的钢纤维，研究了缺口深度比对纤维增强混凝土的影响。 kg / m3（0.50％）（系列2），在150毫米×150毫米×600毫米的棱柱形试样上经受弯曲张力（即三点弯曲试验）的试样中。通过在试样的[15,17,18,29]中形成13、25和50 mm的缺口，可以控制裂纹的产生，从而使缺口与深度的比率（a /d）为0.08、0.16，和0.33。本文研究的目的是通过计算特征残余应力来研究对钢纤维残余性能的影响，混凝土面积的减少以及对残余强度的分类，从而确定钢纤维的强度。裂纹的扩大和向缩小的混凝土区域的传播。本研究的新颖之处在于确定缺口深度比（a / d）小于0.16的纤维增强混凝土的残余性能。这与文献中的其他研究不同，后者考虑了更大的陷波深度比。考虑较低的比率可以研究断裂后的行为以及在断裂过程区域中比标准更大的断裂能量。2.理论方面为了理解（a / d）比的影响，有必要提及混凝土中非线性断裂力学的一些概念。一般而言，断裂力学被定义为具有很大实用性的失效理论，因为它利用了高能准则，该准则与强度准则一起考虑了裂纹在结构中的传播[30]。但是，尽管有其实用性，但已发现，混凝土的性能并不能通过线性弹性断裂力学（LEFM）来定义，因为混凝土会形成较大的断裂加工区（FPZ），可承受由于软化而引起的渐进破坏由微裂纹引起的。这导致裂纹尖端释放的能量流减少；同时，裂纹的组合表面积增加，从而提高了断裂过程区（FPZ）的能量吸收能力，因此，要了解混凝土的性能，必须详细阐述非线性断裂力学[ 30]。非线性断裂力学是更好地描述混凝土行为的理论之一。非线性断裂力学是对固体裂纹的研究，该裂纹在自然界中表现出非线性的本构响应，这与考虑了几何和材料线性的LEFM相反[31]。根据所施加的载荷，建筑材料可以表现出几种行为。一些材料几乎没有表现出变形能力或没有变形能力，因此被认为是易碎材料。相反，存在被认为是延性的材料。混凝土是一种特殊情况，因为其行为不能完全表征为易碎品，因为它更可能被描述为准易碎材料。在出现第一个裂纹（应变硬化）后，混凝土显示出拉伸应力的逐渐衰减（应变软化），无论拉伸强度有无改善。因此，总的来说，失败可以不屈服[32,33]出现。要考虑的另一个重要方面是能量吸收的能力，它是通过载荷位移或载荷裂纹打开曲线下的面积获得的。考虑能量吸收是必要的，尤其是在动态载荷下，因为它决定了结构的延展性。在易碎材料中，没有FPZ时，弹性能作为表观能量消散。同时，在易延展材料中，FPZ是可耗散大量能量的塑料区，其能量大于表层能量。对于准易碎材料（例如混凝土），FPZ通常大于易碎材料或易碎材料的区域[34,35]，并在破坏前耗散大量能量，从而提供了开裂后的非线性响应（软化） [32]。在确定的体积分数下向混凝土中添加钢纤维可改善延展性并增加FPZ的初始宽度，结果是由于纤维的提取而扩大了区域[36] ]。随机分布的钢纤维在基体开裂后，通过延迟裂纹的形成，限制其生长并减小裂纹尖端的开度位移，显示出最重要的作用，因为纤维通过一种方法抑制了裂纹。提取过程中的桥联机制[37,38]。以同样的方式，钢纤维的使用大大提高了能量吸收和延展性[39]。值得一提的是，混凝土的脆性行为与其抗压强度的增加成正比，而添加钢纤维有助于消除这种脆性，从而导致生产出具有改善的拉伸强度，延展性和抗拉强度的材料。韧性[40,41]。与普通混凝土相比，这种材料显示出延伸的软化分支，其特征在于显着的拉伸残余强度和更高的断裂能[9]，后者是衡量准易碎材料断裂过程的主要成分。3.材料和方法为了进行这项研究，共生产了4种普通混凝土混合物，每种所使用的缺口与深度之比为一种。此外，还生产了8种纤维增强混凝土的混合物（每种纤维百分比为4）。使用水泥OPC 40满足NMX-C-414-ONNCCE-2014 [42]的要求生产混合物；标准粉碎的石灰石骨料，最大尺寸为19 mm（3 / 4jj），细度模量为2.42；水;以及聚羧酸类减水剂作为添加剂。使用的钢纤维是“钩端”纤维，长度（lf）为50毫米，直径（df）为1毫米，长径比（lf / df）为50，拉伸强度为1130 MPa;纤维体积分别为0.25％和0.50％，这是根据标准EN 14845-1，2007 [43]推荐的获得残余强度的体积。该标准还规定最大水泥含量为350 kg / m3，水灰比为0.55。表1列出了每种混合物的组成。表1.混合物组成。材料1号2号S-3孜然（kg / w）350350350添加剂（毫升/千克）1.91.91.9碎石（M.S. 19毫米）（kg / m3）810810810沙（kg / m3）102710201014水（kg / m3）193193193纤维（kg / m3）02040空气含量（％）1.82.52.8坍落度（毫米）130115105网络时间6793.1.断裂试验方法 使用了三种不同的混合物，以及四种不同的切口深度（即0、13、25和50 mm）。需要第一混合物作为参考系列（即，体积纤维，Vf ＝ 0％）。用这种混合物制成每个深度为150 mm×150 mm×600 mm的6根光束。因此，总共构造了24个标本。在第二和第三混合物中，分别使用了0.25％和0.50％的纤维体积（Vf）。因此，对于每种混合物和每种切口深度，总共也要制造24个样品。因此，总共48个棱柱形试样由纤维制成，具有上述尺寸和切口深度。通过对72个样品（普通混凝土和纤维增强混凝土）进行了开槽弯曲挠曲试验，评估了添加钢纤维对开裂后性能的影响，并对其进行了描述。相应的陷波深度比（a / d）分别为0、0.08、0.16和0.33。值得一提的是，开槽步骤是根据标准EN 14651-2005进行的，其中常见的开槽深度为25 mm [20]。在该实验程序中，使用了裂口张开位移法（CMOD）相对于施加的载荷作图。开口的测量采用夹式引伸计进行，标距长度为20 mm，行程为+12 mm / –2 mm（见图1a和2a），目的是估计通过防止诱发裂纹的扩大，具有通过样品的裂纹面传递纤维应力的能力。此外，将线性范围为12.7 mm的线性可变差动变压器（LVDT）放置在试样的中跨处，以测量由于施加的载荷引起的位移，并确定钢纤维对钢的韧性和延展性的贡献。复合材料（见图1b和2b）。 (a) （b）图1.棱柱形试样的拉伸弯曲试验。 （a）通过引伸计夹式Epsilon品牌测量裂纹口的开口。 （b）通过VISHAY品牌的线性可变差动变压器（LVDT）测量样品中跨的挠度。图2.三点弯曲测试的配置，尺寸以mm为单位。 （a）裂纹口的测量。 （b）用LVDT测量中跨位移。3.2.负载和应力处于比例极限实验结果从所述负载在比例极限或从负载为初裂（FL），其为负载的记录到为0.05mm并[a CMOD较大值而获得9，36 ]。借助于等式（1）[ 20 ]计算出在出现第一裂纹时相应的作用应力。其中f L =比例极限处的应力（N / mm 2），F L =比例极限处的载荷（N），L =试样的跨度（mm），b =试样的宽度（mm），hsp =试样顶面与引起裂纹的尖端之间的距离（毫米）。3.3.正态和特征残余应力在剩余阶段，钢纤维的贡献至关重要。在裂后阶段，该贡献是通过法向应力（f Rj），所测CMOD的每个特定值获得的，并由等式（2）计算[ 20 ]。其中f R，j =在点j处的法向残余应力（N / mm 2），f Rk，j =在点j处的特征残余应力（N / mm 2），F R =给定裂纹口开口的载荷位移测量。f R，1，f R，2，f R，3和f R，4的值是0.5、1.5、2.5和3.5 mm裂纹嘴开口的法向残余应力（N / mm 2） ， 分别。以类似的方式，f Rk，1，f Rk，2，f Rk，3和f Rk，4的值是0.5、1.5、2.5和3.5 mm的特征残余应力（N / mm 2）。分别开口。在这项研究中，特征残余强度的评估是根据CEB-FIP模型代码2010 [ 44 ]中建立的程序，通过方程式（3），以及在Molins和Arnau 2012中获得的因子进行的；RILEM TC-162，2003，在所列出的表2 [ 45，46 ]。 其中，n =测试样本的数量，k xN =当总体集合的变异系数已知时的统计因子，k xn =当总体集合的变异系数未知时的统计因子。 表2. 系数k x与被测样品数量的关系。n123456810κξγ2.312.011.891.831.81.771.741.72κξγ3.372.632.332.1821.92 3.4.断裂能纤维增强混凝土试件的断裂能估算采用了两种模型，它们各自的参数和原理互不相同。对于模型1，Barros等人提出。[ 47 ]如式（4）所示，需要诸如样品质量和最终位移的测量参数。另一方面，对于第二个模型，需要使用图[ 48 ]。Kazemi等人提出的模型2。[ 48 ]由等式（5）表示，并假设将试样断裂所需的功与破裂表面成正比：其中GF=总断裂能（N/ m）; Wf=曲线载荷下的面积与裂缝开度（或位移）的关系，是由于断裂引起的功（N-m）或（J）；m =样品质量（kg）； a =样品的总长度（l）与跨度（支撑之间的长度）（L）之间的关系； a0 =初始切口深度（m）； b =样品宽度（毫米）； d =光束深度（米）； g =重力加速度常数（9.8 m/ s2）；Su=测得的位移或裂纹开口的最大值（m）； S =装置的标准偏差（N /mm2）；L =试样长度（毫米）； r =试样顶面与裂纹尖端之间的距离（m）。4.结果与讨论4.1.比例极限行为图3显示了三个系列中每个系列在比例极限下的负载获得的结果。可以观察到，随着切口深度比（a/ d）的增加，负载能力降低，其中对于比率（a/ d）分别降低了33％，53％和66％分别为0.08、0.16和0.33。因此，随着切口-深度比的增加，混凝土变得易于破裂失败。这种现象是由于断裂加工区（FPZ）的减少，也称为韧带长度，它在开裂过程中允许更高的能量耗散[48]。 Zihai Shi [49]也认识到了这种负荷的减少，其中韧带长度的减少导致峰值负荷的减少。图3. 比例极限下的实验行为。以相同的方式，在图3中，还可以观察到，负载阻力主要取决于混凝土的阻力面积，而不取决于所添加的纤维量。这可以通过观察在不同纤维体积Vf下每个比率（a / d）所获得的相似载荷值来识别，这表明，对于第一个裂纹发展之前的阶段，纤维几乎或根本没有影响复合材料的强度。从该行为，获得了一般图形（参见图4），其行为也可以用公式（6）描述。 图4. 比例极限下的一般行为。表3列出了每个研究系列的第一个裂纹出现所需的应力。在该表中，计算的应力趋于随着切口深度的增加而减小。另外，对于那些没有初始刻痕的试样，与具有初始刻痕的试样相比，要求更高的应力才能使第一个裂纹出现。与最初产生缺口的混凝土面积相比，这种行为与试样中混凝土面积更大。但是，值得注意的是，（a / d）= 0的试样显示出较大的变异系数（CV），这是因为未控制开裂过程，并且在试样的整个长度上裂纹可能出现在不同的区域，导致残余行为的变化。表3. 在比例极限（N / mm 2）处的计算应力。对于系列1和2，获得的结果分散最少，比率（a / d）= 0.16，这是标准EN 14651，2005 [ 20 ]所建议的陷波深度比。与所研究的其余（a / d）比率相比，观察到了裂化过程的控制。此外，比率（a / d）＝ 0.16时，在后裂化阶段中获得了纤维性能的更代表性的行为。而且，以该比率，深度足够大，以利于在所需区域中出现第一裂纹，并产生足够大的混凝土区域，以使纤维在残余阶段中适当地传递应力。4.2.破解后行为图5-8显示了在弯曲拉伸试验中，钢纤维系列和每种（a / d）比的结果。在这些图中，可以注意到，如前所述，在比例极限（曲线的线性部分）处的负载与所用纤维的数量无关。此外，还可以观察到，纤维的主要作用是在后裂化阶段获得的[13,15,50]。 图5. （a / d）= 0的弯曲拉伸试验曲线：（a）系列1和（b）系列2。 在对应于系列2的图中，与对应于系列1的那些相比，在裂后阶段显示了更大的性能，其残余载荷等于或什至大于在第一裂化过程中获得的平均载荷。发生阶段。由于使用了大量的纤维（即，Vf ＝ 0.50％），这导致硬化行为，这通过增加通过裂纹面传递应力的能力而改善了裂纹后阶段的性能。图6. （a / d）= 0.08的弯曲拉伸试验曲线：（a）系列1和（b）系列2。图7. （a / d）= 0.16的弯曲拉伸试验曲线，（a）系列1，（b）系列2。通过分析这两个获得的曲线的结果，在图5-8中，可以在残余阶段以小于4 mm CMOD的值观察到样品的最大性能，这相当于在3.64 mm处的位移。中跨，之后开裂性能会降低。这是最重要的，因为通常在计算光纤性能时考虑该值，对于中跨度的3.5mmCMOD或3mm挠度，该值是获得的[9]图8.（a / d）= 0.33的弯曲拉伸试验曲线：（a）系列1和（b）系列2。 4.3.正常残余应力在图9中，显示了两个研究系列的法向残余应力（fR，j）的结果。基于所使用的（a / d）比率，可以注意到，从图9a-d中可以看出，比例极限处的载荷值是一致的，与所使用的纤维量无关。这表明纤维在第一次破裂发生之前的阶段几乎没有影响。还值得注意的是，通过增加比率（a / d），通过增加纤维的剂量可以改善所产生的残余性能。例如，比率（a / d）=0的样品的残余性能增加了61％。同时，（a / d）比分别为0.08、0.16和0.33的序列分别增加了157％，129％和86％。以相同的方式，对于0.08至0.16的比率，随着纤维剂量的增加而达到最大性能，而对于0.33，其残余性能降低。4.4.特征残余应力在图10a，b中，显示了系列1和2的每个（a / d）比的特征残余应力（fRk，j）的实验结果，以及每种情况下它们的相应平均应力曲线。可以注意到，特征残余应力对法向残余应力的变化非常敏感。这可以在图10a中得到验证，图10a中的比率（a / d）= 0和0.08显示的残余性能低于从比率（a / d）= 0.16和0.33获得的残余性能。因此，比率（a / d）= 0和0.08不符合标准EN 14845-2，2006 [41]中确定的最低要求。对于系列1，通过增加比值（a / d），可以在开裂后阶段获得更合适的性能，这表明在试样表面上有足够的应力传递。另一方面，在图10b中，通过使用大量的纤维（系列2），特征残余应力满足标准的最低要求[41]。但是，关于系列2的比率（a / d）的行为与在系列1中获得的结果不一致，因为比率（a / d）= 0.08提供了所有所用比率中的最佳残留性能（请参见图10b）。这可能是纤维数量影响的结果，纤维数量可以在较大的混凝土区域中更好地分布。对于两个系列，比率（a / d）= 0均显示最差的性能。(b) （b） (c) （d）图9.纤维系列和每个研究的（a / d）比（a）0，（b）0.08，（c）0.16和（d）0.33的残余法向应力。切口深度比对钢纤维混凝土开裂后行为的影响(下） 点击：查看更多其他分类文章 免费试用文档翻译功能免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网站无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。 来源于：mdpi

克拉拉·尼古拉斯（ClaraNicolas）1，*，王玉佳（Jiang Wang）1，珍妮弗·吕布·惠勒（Jennifer Luebke-Wheeler）1和斯科特·尼伯格（Scott L.Nyberg）1,2收到：2015年11月25日；接受：2015年12月31日；发布时间：2016年1月6日学术编辑：邓文斌1 William J. von Liebig移植和临床再生中心，梅奥诊所，罗切斯特，MN 55905，美国； wang.yujia@mayo.edu（Y.W.）; luebke-wheeler.jennifer@mayo.edu（J.L.-W.）; nyberg.scott@mayo.edu（S.L.N.）2 美国罗切斯特市梅奥诊所外科科，美国明尼苏达州55905 摘要：细胞疗法是几种肝脏疾病的新兴治疗形式，但受到供体肝脏可用性的限制。干细胞有望替代原代肝细胞。我们对文献进行了详尽的回顾，重点是涉及使用干细胞治疗肝病的最新研究。干细胞可以从多种来源中收获，或者可以从体细胞中产生以产生诱导性多能干细胞（iPSC）。实验上已经使用了不同的细胞系来支持肝功能，并治疗遗传性代谢异常，急性肝衰竭，肝硬化，肝癌和小型肝移植。基于细胞的疗法可能涉及基因疗法，细胞移植，生物人工肝装置或生物工程器官。该领域的研究仍然非常活跃。将来，干细胞疗法可被用作肝移植或内源性肝再生的桥梁，但是必须开发有效的分化和生产方案，并且必须证明其安全性，然后才能将其应用于临床实践。关键词：干细胞；肝病;诱导多能干细胞；基因校正细胞移植生物人工肝再生医学细胞疗法1. 介绍迄今为止，肝移植是治疗药物难以治疗的多种肝病的唯一有效方法。不幸的是，对供体器官的需求大大超过了其供应，因此有必要替代全器官肝移植进行治疗。针对可移植肝脏的短缺，已经出现了细胞疗法。已经评估了离体肝脏支持疗法和体内细胞移植，并显示了治疗肝衰竭的潜力。肝脏由于其内源性的再生和修复能力强，因此特别适合这种疗法[1-3]。分离的原代肝细胞是体内和离体细胞疗法中要测试的第一类细胞，但是它们的使用受到许多尚待克服的技术难题的限制。肝细胞在体外培养中不能长期存活[4]，因为（1）体外生长能力极低[5]，（2）肝特异性基因的表达在体外迅速下降[6]和（3）易冻性融化的破坏使冷冻保存变得复杂[7]。然而，使用它们的主要限制是由于供体肝脏的缺乏，无法分离出高质量的原代肝细胞，因此无法满足临床对肝细胞的需求。随着再生医学的到来，肝细胞治疗的重点已经稍微转移到干细胞的治疗潜力上，这是一种在组织损伤后恢复正常结构和功能的手段。干细胞的分化和自我更新能力使其成为无数肝细胞生成的合理来源。因此，干细胞疗法可以替代全器官肝移植在治疗肝脏疾病方面具有广阔的前景。几种类型的干细胞已被证明适用于肝细胞置换。在这篇综述中，我们探讨了每种细胞系的优势和局限性，以及可能从干细胞疗法中受益的各种肝脏疾病。 2. 干细胞来源用于肝病治疗2.1. 肝干细胞干细胞可以从成年或胎儿肝脏获得。成人肝干细胞（也称为卵圆细胞）和胎儿肝干细胞（称为成肝细胞）都是双能的，因此能够分化为肝细胞或胆管细胞[8-10]。已经证明，当肝细胞的复制能力受损时，卵形细胞会在肝再生中发挥作用[11]，而在动物模型中，已通过实验将成肝细胞用于肝再生[12,13]。人成肝细胞也已被培养，并已显示出移植到免疫缺陷小鼠体内后在体内的植入和分化[14]。使用肝源性干细胞的主要限制是正常肝中它们的数量非常低，卵圆形细胞仅占成年肝的0.3％至0.7％[15]，而成肝细胞仅占成年肝的不到0.1％。胎儿肝脏肿块[16]。这使得它们的隔离和扩展具有挑战性，从而限制了其在小规模使用中的应用。2.2. 骨髓干细胞骨髓干细胞包括造血干细胞和间充质干细胞（MSC）[17]。 MSC是在骨髓和其他成年器官和组织（例如脂肪组织）中发现的多能祖细胞，它们很容易获得，并且可以在培养物中快速扩增[18,19]。在这两个细胞群中，已建议MSC具有更高的肝再生潜力[20]。此外，它们比造血干细胞具有另一个优势：它们具有免疫调节或免疫抑制特性，可下调T细胞，B细胞和NK细胞的功能[21]。在临床上，这可以转化为肝移植后诱导耐受的能力。2.3. 附件干细胞附件干细胞是容易获得的细胞，其衍生自人胎盘组织，脐带和脐带血以及羊水。它们是多能的，因此与成体干细胞相比，它们具有更高的分化潜能，并且具有更高的增殖率[22-24]。附件干细胞还提供了另一个优势：尚未描述它们可在人类中形成畸胎瘤或畸胎瘤。在一项研究中，急性毒性肝损伤后向非肥胖型严重合并免疫缺陷小鼠腹膜内施用人脐带血干细胞显示出快速的肝移植，分化为肝细胞，改善了肝的再生并降低了死亡率[25]。2.4. 胚胎干细胞（ESC）ESC是全能细胞，可以分化为类肝细胞，具有损伤后能够在肝脏中定植的能力，并且具有与成熟肝细胞相似的功能[26]。但是，使用ESC有两个主要限制。首先，它们的采购涉及胚胎的破坏这一事实引起了道德上的担忧，这些担忧抑制了ESC研究的进展[27]。其次，ESC移植的供体和受体之间存在免疫不相容的问题[28]。尽管如此，ESC的研究仍在进行中，最近的一项研究揭示了一种分化为新生儿肝细胞的有效方案，该新生儿肝细胞能够在体内无肿瘤诱导地繁殖肝脏，并在对乙酰氨基酚引起的毒性小鼠中拯救肝脏功能[29] 2.5. 诱导多能干细胞（iPSC）iPSC具有与ESC相似的特性，包括多能性和自我更新，但避开了使用此类细胞固有的主要问题。 iPSCs是由体细胞在体外产生的，无需使用胚胎组织或卵母细胞，从而避免了伦理争议[30]。此外，它们提供了自体使用的可能性，解决了异体排斥的问题。 2006年首次描述的iPSC的使用已迅速发展为胚胎干细胞的有前途的替代方法，但在考虑将其应用于临床之前，必须解决几个问题，并且必须确定它们与ESC的等效性[ 32]。图1显示了iPSC和ESC之间的生产差异。 图1.胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的产生。 iPSC可能来自多种细胞来源，并且有人提出，它们的起源可能在它们的分化能力中发挥作用[33,34]。尽管成纤维细胞是人类iPSC（hiPSC）的最常见来源，但这些细胞也已成功地从多种其他体细胞类型（包括原代肝细胞）中重新编程[35]。然而，已经有人提出，与其他来源的细胞相比，肝细胞来源的细胞系对畸胎瘤形成的倾向可能更高。有证据表明，由于hiPSC系的表观遗传记忆力会随着时间的流逝而丢失，因此可以从多种来源的iPSC成功诱导肝分化[37]。实际上，研究表明，可预测的iPSC分化与体细胞来源无关，而是在很大程度上取决于所使用的重编程策略[39]。其他作者建议，相反地，iPSCs具有偏斜的分化潜能，这源于它们的谱系特异性表观遗传记忆，使它们易于分化为起源的细胞类型[40]。需要进一步的研究来阐明这一点，并找到最合适的细胞来源来产生能分化为肝细胞的hiPSC。还存在对iPSC进行重编程的不同方法，有关iPSC生成的第一份报告是由逆转录病毒载体组成的，用于诱导多能性。该方法受到病毒转基因自发再激活及其整合入宿主基因组的可能性的限制，这转化为形成肿瘤的风险[41]。但是，在过去两年中，成功解决了iPSC生成问题。例如，hiPSC现在可以由不整合到靶细胞基因组中的载体产生[42,43]，甚至可以由小分子化合物诱导[44,45]。迄今为止，尚未从iPSC或ESC获得体外完全成熟的肝细胞。获得的称为肝细胞样细胞（HLCs）的细胞具有原代肝细胞的大部分特性，但功能上并不成熟，如其较低的白蛋白生成水平，CYP活性和尿素循环活性以及通过它们持续表达高水平的甲胎蛋白[46]。已经开发出许多分化方案[47-49]，并且通过三步方案将分化时间从平均超过20天减少到12天，从而提高了其效率[50,51]。 Asgari等。 [52]将hiPSC衍生的HLC表征为表达肝细胞特异性标志物，糖原和脂质存储活性，白蛋白分泌和CYP450代谢活性，并且在移植后，这些细胞具有改善CCl4损伤的小鼠肝脏功能状态的能力[ 52]。最新研究集中在将成纤维细胞直接谱系重编程为人诱导的肝细胞，已产生具有药物代谢功能的功能性和可扩展性细胞[53,54]。尽管如此，分化方案必须在临床应用可行之前进行优化，因为已经表明完全分化的细胞移植后具有较低的畸胎瘤形成风险[55]。必须消除残留的未分化细胞，不仅避免畸胎瘤的形成，而且避免对多能性抗原产生免疫反应的可能性[56]。此外，分化后必须仔细研究目的细胞类型的免疫学特性[57,58]。必须克服的另一个障碍是缺乏高效，大规模的hiPSC生产系统，因为单层静态组织培养物将无法维持临床应用所需的快速细胞扩增。在这方面已经取得了进展，iPSC培养物以3D悬浮液的形式聚集[59]。 3D培养的优势是可以高密度培养hiPSC [60]，同时可以增加HLC向成年表型的功能成熟度，并提高其功能寿命[61]。尽管有这些挫折，但仍取得了令人鼓舞的结果。朱等。 [62]能够通过缩短重编程规程以避免多能性，通过诱导多能祖细胞（iMPC）而不是iPSC来区分人成纤维细胞中的肝细胞[62]。然后，他们在人肝衰竭的免疫缺陷小鼠模型中实现了肝脏再填充，其肝细胞功能水平与人成年原代肝细胞相似。此外，通过阻止细胞进入多能状态，很可能防止了肿瘤的形成。已经发现，不涉及基因组整合的重编程方法以及通过在重编程过程中去除c-Myc均可降低iPSCs的致瘤性和免疫原性[64]。关于iPSCs的致癌潜力，最近在恒河猴中进行了自体畸胎瘤形成试验，得出的结论是，虽然未分化的自体iPSC形成畸胎瘤，但iPSC衍生的祖细胞在体内产生功能组织而没有肿瘤迹象形成[65]。此外，未分化细胞形成的畸胎瘤的生长效率比同等啮齿动物模型低至少20倍，这可能是由于完整的免疫和炎症系统的存在所致。它与人类生理学的相似性使这种非人类灵长类动物模型对于基于iPSC的疗法的研究非常有价值。 iPS细胞进行了研究，已经在许多不同的肝脏疾病的背景下对iPSC进行了研究，但是iPSC的最直接用途可能是人类肝脏疾病的建模和体外药物测试[66,67]。3. 干细胞用于肝病治疗的技术干细胞向HLC的分化可以在使用前在体外实现，也可以在细胞移植后在体内实现。体外培养和分化正在广泛研究中，并且仍在创造新的，更有效的方案。但是，干细胞在注射后也具有体内分化为HLC的能力。不同细胞系都是如此。在一项研究中，静脉注射纯化的造血干细胞显示出在富马酰乙酰乙酸水解酶（FAH）基因敲除小鼠体内向HLC分化，从而恢复了肝功能[68]。 FAH´ {´小鼠是I型酪氨酸血症的动物模型，在研究代谢性肝病的再生疗法方面具有巨大潜力。在这些动物中，非FAH缺陷型野生型细胞由于具有选择性优势，可以在移植后大量繁殖肝脏。当FAH基因敲除与免疫缺陷等位基因结合时，人类细胞可用于重新填充肝脏，形成嵌合器官[69]。为了提供更具临床意义的动物模型，还创建了FAH´ {'猪，可用于测试不同细胞疗法的功效[70]。此外，如果可以在这些动物中充分实现肝脏人源化，则可以将它们用作活体生物反应器，以生产大量功能性人肝细胞。图2显示了FAH基因敲除猪的创建及其作为原代人肝细胞培养箱的可能用途。 图2.用人类肝细胞填充FAH缺陷型猪肝。尼替农（NTBC）用于治疗FAH缺乏的动物，同时发生肝细胞移植和增殖。 其他细胞系，例如小鼠ESC和人类骨髓来源的MSC，也已被证明可以在体内分化为HLC [71,72]。尽管如此，在考虑临床应用之前，必须更深入地研究体外和体内信号模式，分化机制和最佳增殖条件，尤其是因为数据表明成熟肝细胞的移植和再繁殖能力要比干细胞高。 [73]。4. 干细胞在肝脏疾病中的潜在应用4.1. 遗传性肝病遗传性肝病中的细胞疗法不仅可以充当肝移植的桥梁，而且还为长期纠正代谢缺乏症提供了机会[74]。原代肝细胞移植已用于治疗人类的多种疾病，包括家族性高胆固醇血症，1型Crigler-Najjar综合征和尿素循环缺陷等[75]。同时患有Crigler-Najjar 1型和尿素循环缺陷的患者正在接受I期临床试验，以治疗由正常成人肝脏组织产生的异源人类成人肝脏祖细胞悬浮液[76]。但是，如前所述，供体器官不足，无法从中分离出高质量的肝细胞，必须考虑同种异体排斥的可能性。自体移植可以避免同种异体排斥，但是只能通过肝切除获得足够数量的自体原代肝细胞。可以通过使用iPSC来避免此问题。随着干细胞技术的发展，尤其是iPSC的发展，遗传性肝病的治疗可以进一步向前：通过将基因校正技术与自体细胞移植相结合，可以创建针对患者的治疗方法[77,78]。无病的自体hiPSC首先通过离体基因治疗产生[79]，然后经过基因校正的hiPSC分化并用于移植。图3显示了如何将hiPSC与基因校正和分化技术结合起来以生产自体，无病的肝细胞进行移植。 图3. iPSC的基因校正，用于产生患者特异性无病肝细胞。 从理论上讲，这种方法可以应用于任何已知潜在突变的遗传性疾病，并且已经在造血疾病的动物模型上进行了测试，结果令人鼓舞[80]。在hiPSC中，α1-抗胰蛋白酶的缺陷也得到了基因纠正，从而在在小鼠的体内和体内分化的HLC中恢复了蛋白质的功能,[81]。家族性高胆固醇血症患者的hiPSC也已成功产生了经过疾病校正的HLC [82]。根据这些研究，自体基因校正的hiPSC衍生的肝细胞的移植显示出治疗遗传性肝病的希望。可以在4到5个月内获得针对患者的无病hiPSC系列产品[83]。另外，hiPSC可以用于遗传性代谢疾病的建模和研究[51]。4.2. 急性肝衰竭（ALF）如前所述，肝脏具有相当大的内源性再生能力[84]。当它遭受急性损伤时，修复机制就会生效，在许多情况下，修复机制将能够随着时间的推移恢复功能正常的存活肝[85]，但是在再生过程中必须支持肝功能[86]。已经尝试了两种不同的方式：通过细胞移植或通过生物人工肝（BAL）系统。细胞移植可以为ALF或慢性慢性肝功能衰竭提供临时解决方案。 Pareja等。 [87]在急性慢性慢性肝衰竭患者中进行了肝细胞移植，取得了令人鼓舞的结果，包括改善高氨血症和脑病程度[87]。同样，永生化的人类胎儿肝细胞的移植显着提高了90％肝切除术后小鼠的存活率[88]。肝细胞与骨髓间充质干细胞的共包封不仅增加了移植[89]，延长了肝细胞的生存能力，而且还增强了其在体内和体外的肝细胞特异性功能[90]。当单独移植时，骨髓来源的MSC可减轻小鼠的肝损伤并抑制肝内NK细胞活性[91,92]。此外，有证据表明，仅由MSC条件培养基产生的免疫调节就足以消除对供体肝细胞的需求[93]。 MSC衍生的外泌体也已被证明可以激活再生反应，从而在CCl4损伤的小鼠中导致增殖蛋白的更高表达[94]。与基于细胞的疗法相比，这些疗法的优势在于它们不太可能触发免疫反应。关于iPSC，Chen等。 [50]证明，在应用其三步分化方案后，iPSC衍生的HLC在严重的联合免疫缺陷小鼠模型中挽救了致命的暴发性肝衰竭[50]。BAL的另一种有希望的治疗方法是BAL，BAL是一种体外支持疗法，可以在执行活性肝细胞的生物转化和合成功能的同时去除毒素[95]。该系统旨在桥接ALF患者，使其通过再生来恢复天然肝脏或进行肝移植[96]。第一个被批准用于II / III期试验的BAL是基于猪肝细胞的装置，该装置在ALF患者的一项前瞻性，随机对照试验中进行了评估。对暴发性或亚暴发性肝功能衰竭患者进行亚组分析可提高生存率，但未达到整个研究人群生存的主要终点[97]。尽管原代猪肝细胞是BAL试验最常用的细胞来源[98]，但永生化的C3A人肝母细胞瘤细胞也已在体外肝辅助装置（ELAD）中进行了试验[99]，尽管尚无随机对照试验显示生存获益日期和荟萃分析结果尚无定论[100,101]。 HepaRG细胞是人类肝双能祖细胞系[102]，能够在暴露于二甲基亚砜（DMSO）[103]后分化为肝细胞簇和周围的胆管上皮样细胞[103]，目前正在阿姆斯特丹医疗中心进行BAL应用的评估（AMC）生物反应器，结果不一[104,105]。与无细胞BAL治疗相比，HepaRG-AMC-BAL已显示增加了ALF大鼠的存活时间[106]。为了成功地将BAL用于临床，似乎每种治疗方法至少必须可使用200 g功能性肝细胞。由于这个原因，由于原发性人类肝细胞的可用性有限以及它们在体外的短功能性和生存力，目前尚不实用。这些问题已通过使用肝细胞球体解决，该球体可保护细胞免于凋亡，并允许在治疗期间使用更大的细胞量[ 107 ]。猪肝细胞的使用也受到异种性和xenozoonosis的限制，而永生化细胞系的使用受到其基本细胞功能的丧失（如尿素循环和CYP酶活性）的限制[ 108]。因此，ESC和iPSC有望成为BAL设备的细胞来源。Soto-Gutierrez等。[ 109 ]显示，在90％肝切除的小鼠中，用皮下植入的BAL植入ESC衍生的HLC来治疗ALF可改善其肝功能，并延长其生存期[ 109 ]。iPSC的初步研究还表明，在生物反应器模块中培养7天后，这些细胞分化为HLC [ 110 ]。 时间限制是使用干细胞治疗ALF的主要限制之一。ALF疗法需要快速且有效地产生大量细胞，因此按照当前方案，培养和分化自体细胞所需的时间可能是禁止的，这使得同种异体肝细胞成为更实际的选择。一旦建立了有效且快速的分化为HLC的方案，使用HLA / MHC与HLA / MHC密切匹配的iPSC库是一项需要进一步研究的选择[ 108 ]。 点击：查看干细胞疗法治疗肝病（结论） 查看更多医学类文章免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网站无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。来源于：mdpi

褪黑激素能否成为治疗COVID-19患者的潜在“银弹”？（上）6. 褪黑激素和神经保护在患有严重COVID-19疾病的患者中，已记录到神经系统并发症，包括失眠，中风，瘫痪，颅神经功能缺损，脑病，del妄，脑膜炎和癫痫发作（参见，例如[64,96]）。神经系统异常是否由SARS-CoV-2本身，由其触发的夸大的细胞因子反应和/或由脑血管中血块形成的增加引起，尚待确定。在有神经系统症状的患者中，脑脊液自身抗体增多[97]，脑白质改变[98,99]以及发生心理和精神病学后果[100]。在最近的研究中（截至目前（2020年11月23日）作为预印本发布），认知测试数据来自84,285名英国智能测试参与者，他们完成了有关可疑和生物学确认的COVID-19感染的问卷调查[101]。在控制了年龄，性别，教育水平，收入，种族，种族和先前存在的医学疾病之后，那些已经康复的人（包括不再报告症状的人）表现出明显的认知缺陷。在该数据集中，观察到的赤字规模相当于20至70岁之间的全球绩效平均10年下降。作为比较，这组作者指出，这一赤字大于平均512名表示中风的人和1016名患有学习障碍的人的平均赤字[101]。因此，“脑雾”，即混乱，健忘，无法集中注意力，疲倦和智力低下[102,103]可能因此成为COVID-19感染的新兴主要后遗症（图1）。在这种情况下，褪黑激素的神经保护特性值得考虑[104]。对在认知能力下降早期使用褪黑激素的已发表数据进行的分析一致显示，退休前每晚服用褪黑激素可改善睡眠质量和认知功能疾病[105]。褪黑激素治疗的患者表现出明显好转在各种神经心理学测试中的表现。他们在贝克抑郁量表中的得分也较低，同时睡眠和清醒的质量得到改善[106]。图1.褪黑激素是COVID 19大流行中潜在的“银子弹”，如大脑所示。褪黑素可能通过干扰SARS-CoV-2 /血管紧张素转换酶2的缔合而具有抗病毒活性。褪黑激素作为一种抗氧化剂，抗炎和免疫调节化合物，会损害SARS-CoV-2感染的后果。褪黑激素是一种有效的生长期药，可逆转重症监护病房患者的昼夜节律紊乱和del妄。褪黑激素可以预防COVID-19感染患者的神经后遗症，例如“脑雾”和认知功能减退。褪黑激素可以作为增强抗SARS-CoV-2疫苗功效的佐剂。 BBB：血脑屏障。视网膜细胞特别容易发生神经变性。例如，在帕金森氏病患者中，有较薄的筛板（视网膜视神经轴突行进的部位）[107]。最近的一项研究[108]探索了褪黑素治疗对认知障碍最小的患者的筛板厚度的影响。 6个月后，用0.15mg/kg褪黑素可显着增加筛板的厚度和海马体积，与未经治疗的组相比，CSF的tau含量降低，并且迷你智力得分提高。总的来说，这些数据支持褪黑激素减少大脑变性的有效性，并强调其在COVID-19的神经系统后遗症中的治疗意义。7. 褪黑激素作为抗SARS-CoV-2疫苗的佐剂现在，许多制药公司都在努力生产针对SARS-CoV-2的安全有效疫苗。但是，即使建立了这种疫苗，与健康和年轻人相比，老年人和其他高危人群的疫苗功效也可能较差。褪黑激素可能有助于缩小这方面的差距[109]。褪黑激素可以增加IgG抗体反应并抵消皮质类固醇和/或急性应激的免疫抑制作用的第一个证据[110]。褪黑素可有效对抗衰老中观察到的免疫抑制[111,112]。褪黑激素的这种作用与CD4 + T淋巴细胞的增加有关[113]。关于疫苗，多项研究表明，外源性褪黑激素可作为佐剂，改善癌症疫苗中的CD8 + T细胞反应[114,115]，以及针对多种病原体的体液反应[116]。褪黑激素通过增加褪黑素来增强对疫苗的免疫反应外周血CD4 + T细胞和IgG表达B细胞。这些发现特别有趣，因为最近对恢复期的COVID-19患者进行的一项研究发现，CD4 + T细胞对刺突蛋白（大多数疫苗的主要靶标）有强烈反应，而且这种反应与抗SARS-S水平相关。 CoV-2 IgG和IgA [117]。然而，在许多患者中，由于已经报道了复发，因此免疫反应可能还不够，因此，长期的自然免疫似乎无法阻止当前和将来的发作[118]。因此，必须开发有效的疫苗以控制该疾病。 COVID-19患者，特别是老年患者，显示出CD8 + T细胞数量减少抑制IL-2和IL-2受体。众所周知，褪黑激素可以刺激IL-2的产生，并且这样做可以使CD4+ T细胞增加[119]。因此，将其用于抗SARS-CoV-2疫苗可增强对病毒最有效的免疫力。外源性褪黑激素的给药可以增加免疫反应的效力和疫苗诱导的免疫持续时间。而且，由于褪黑素具有抗氧化特性和对免疫系统的多效作用，因此它也可以预防疫苗的不良反应[109]。8. 结束语毫无疑问，当前的COVID-19大流行是最近历史上最具破坏性的事件。该病毒对年轻人造成的损害相对较小，但对老年人和患有慢性炎性疾病的人则构成威胁生命的危险。与其他原因相比，年轻人遭受COVID-19的痛苦不及老年人，因为他们的循环褪黑素水平更高。病毒会引起炎症细胞因子和活性氧的显着增加，而褪黑激素是最好的天然抗氧化剂，抗炎症细胞保护剂，在老年患者中的含量非常低[34]。严重受损的COVID-19患者的一般免疫力受损，褪黑激素可刺激免疫力。因此，以足够的剂量使用非常安全的褪黑激素药物可以预防冠状病毒患者中严重疾病症状的发展，减轻其症状的严重性，和/或减少在活动后冠状病毒感染对患者健康的免疫病理学感染阶段已经结束。此外，褪黑激素可能有助于减少再感染，并作为未来疫苗的强大免疫增强佐剂（图2）。 图2.褪黑激素作为SARS-CoV-2感染中的多因素治疗剂。有关说明，请参见文本。 ROS：自由基氧；RNS：自由基氮。L / M R：淋巴细胞/单核细胞比率。参考文献(展示部分，其余可到原网站查看)1. 罗比（Roby，C.A.）狼人（幻想生物）；卡文迪许广场：美国纽约，2005年。2. 张荣;王X. 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丹尼尔b。格雷戈里·卡迪纳利m。 Brown ௨和新闻稿r。 Pandi-Perumal ௩，*1 阿根廷天主教大学，医学院，阿根廷布宜诺斯艾利斯1007； daniel_cardinali@uca.edu.ar2 多伦多大学精神病学中心成瘾与心理健康中心，加拿大，多伦多，M5T 1R8； gregory.brown@camh.ca3 Somnogen Canada Inc.，加拿大安大略省M6H 1C5，多伦多大学街* 对应：Pandiperumal2020@gmail.com收到：2020年11月4日;接受：2020年11月24日;发布时间：2020年11月26日 摘要：提倡褪黑激素作为一种慢性细菌细胞保护剂，可以抵消COVID-19感染的后果。由于其作为抗氧化剂，抗炎药和免疫调节化合物的广泛作用，褪黑激素在损害SARS-CoV-2感染后果方面可能是独特的。此外，间接证据表明褪黑激素可能通过干扰SARS-CoV-2/血管紧张素转化酶2的缔合而发挥抗病毒作用。褪黑激素还是一种有效的生时剂，可以逆转昼夜节律对社会隔离的破坏，并控制重症患者的del妄。褪黑激素作为一种细胞保护剂，可抵抗多种合并症，例如糖尿病，代谢综合征以及缺血性和非缺血性心血管疾病，这些疾病会加重COVID-19疾病。鉴于有证据表明感染COVID-19的患者会出现神经后遗症，因此褪黑激素的另一种潜在应用是基于其神经保护特性。由于褪黑激素是在最小程度的认知障碍中控制认知衰退的有效手段，因此应考虑其对SARS-CoV-2感染神经后遗症的治疗意义。最后，但很重要的是，外源性褪黑激素可以作为佐剂，能够增强抗SARS-CoV-2疫苗的功效。我们在这篇综述中讨论实验证据表明褪黑激素是COVID 19大流行中潜在的“银子弹”。 关键词：老化抗SARS-CoV-2疫苗接种；计时疗法; 2019冠状病毒病大流行;细胞保护；糖尿病;炎;代谢综合征;褪黑激素认知障碍;神经变性氧化应激肾素-血管紧张素系统1. 介绍根据维基百科的说法，在民间传说中，用银子弹铸成的子弹通常是对付狼人或女巫的少数武器之一[1]。该术语也是对一个难题的简单，看似神奇的解决方案的隐喻：例如，青霉素是可以治疗并成功治愈许多细菌感染的灵丹妙药。我们在本次迷你讨论中讨论了褪黑激素（一种在所有已知的需氧生物中存在的异常的系统发育保护分子）作为COVID-19大流行的预防和治疗剂的潜力。这种可能性已成为文献[2,3]的分析主题。作为对该观点的扩展，我们在此讨论暗示褪黑激素（a）预防SARS感染CoV-2的证据； （b）适合作为有效的抗炎/免疫调节/抗氧化剂；（c）抵销计时性破裂； （d）与多种合并症作斗争，例如糖尿病，代谢综合征以及缺血性和非缺血性心血管疾病，这些疾病加重了COVID-19疾病; （e）在急性和慢性感染的SARS-CoV-2患者中发挥神经保护作用；（f）可以作为增强抗SARS-CoV-2疫苗的佐剂。这种多因素治疗潜力是褪黑激素所独有的，而其他任何针对COVID 19大流行的治疗药物均无法共享。通过搜索包括MEDLINE和EMBASE的数据库，已出版文献的参考书目以及临床试验注册中心/数据库来识别医学文献。搜索最后更新于2020年11月23日。2. 褪黑素在SARS-CoV-2感染中的作用SARS-CoV-2病毒通过血管紧张素转换酶（ACE）2进入肺上皮细胞和其他组织器官。病毒粒子表面上的尖峰糖蛋白与ACE2二聚体对接是人类细胞SARS-CoV-2感染过程中必不可少的步骤[4]。全身性肾素-血管紧张素系统失衡导致ACE2表达下调，同时也促进了多器官损伤。ACE2受体必须位于脂质筏中，并且似乎需要形成二聚体以使SARS-CoV-2进入。在SARS-CoV-2对人细胞的攻击中，病毒体表面上的峰状糖蛋白三聚体对接至ACE2二聚体结构是必不可少的步骤[5,6]。膜融合后，病毒RNA基因组被释放到细胞质中并被翻译成两种多蛋白，这些蛋白被SARS-CoV-2主蛋白酶（也称为胰凝乳蛋白酶样蛋白酶）切割，从而形成复制转录复合物。几项实验表明褪黑激素可能是COVID-19中有效的抗病毒药物大流行（例如[7]）。通过实施基于系统药理学的网络医学平台，量化HCoV宿主相互作用组的包膜和核衣壳蛋白与人蛋白质-蛋白质相互作用网络中的药物靶标之间的相互作用，鉴定了16种潜在的抗HCoV可重复利用药物，包括褪黑素，巯基嘌呤和西罗莫司[8]。褪黑素加巯基嘌呤的药物组合被确定可有效击中HCoV宿主子网，并被推荐作为SARS-CoV-2感染的潜在药物组合。在另一项研究中，褪黑激素的结构和理化性质使用电子结构方法和分子力学工具作为褪黑激素针对冠状病毒2蛋白的生物活性的预测因子进行了检验[9]。基于获得的对接分数，作者提出褪黑激素可以有效防御脆弱人群的病毒载量。SARS-CoV-2的主要蛋白酶是一种在冠状病毒物种中保守的酶。通过使用计算机软件识别新的可能的SARS-CoV-2主要蛋白酶抑制剂，分子对接研究描述了74种配体复合物的结合位点和相互作用能[10]。褪黑激素显示与SARS-CoV-2主蛋白酶的相互作用能比其他配体更好。褪黑素调节病毒感染的另一种可能方法与其有效结合和抑制钙调蛋白（CaM）有关[11,12]。 CaM调节ACE2在质膜中的表面表达和保留，并且该钙结合蛋白的抑制剂通过减少CaM与ACE2之间的结合来增强ACE2胞外域的释放[13]。因此，褪黑激素可能是被归类为病毒颗粒融合过程中ACE2-SARS-CoV-2偶联的间接抑制剂。褪黑激素可能具有抗病毒作用的间接证据可能解释了一项研究，该研究监测了11672名具有预测COVID-19感染的统计模型的患者[14]。男性，非裔美国人，老年患者以及已知暴露于COVID-19的患者，其COVID-19阳性的风险较高，而接受褪黑素，帕罗西汀或卡维地洛治疗的患者的风险降低。SARS-CoV-2-ACE2相互作用引起了对基于肾素-血管紧张素系统的COVID-19治疗策略发展的极大兴趣。通常，肾素-血管紧张素系统通过ACE /血管紧张素II /血管紧张素II 1型受体（AT1R）轴诱导血管收缩，高血压，炎症，纤维化和增殖，并通过ACE2 /血管紧张素诱导相反的作用（1-7） / Mas轴功能[15,16]。肾素-血管紧张素系统被慢性炎症激活高血压，糖尿病，肥胖和癌症。 SARS-CoV-2诱导ACE2内化和脱落，导致ACE2 /血管紧张素（1-7）/Mas轴失活。据推测，在已有炎症的患者中，肾素-血管紧张素系统受到两次打击可驱动COVID-19进程。第一个打击源于激活ACE /血管紧张素II / AT1R轴的慢性炎症，第二个打击源于使ACE2 /血管紧张素（1-7）/Mas轴失活的COVID-19感染[17]。肾素-血管紧张素系统的这两次打击可能是导致COVID-19合并症并发低度炎症（例如肥胖症，糖尿病，高血压和癌症）的患者或老年患者死亡率增加的主要原因。褪黑素是血管紧张素II激活的有效抑制剂，可能促进了血管紧张素（1-7）的作用[18-20]。因此，褪黑激素的给药可以抑制肾素-血管紧张素系统的两次打击。3. 褪黑素作为抗炎/免疫调节和抗氧化治疗褪黑素是一种存在于所有形式的有氧呼吸中的甲氧基吲哚，其主要功能显然是细胞保护作用，具有间接的抗病毒作用，作为抗炎药，抗氧化剂和免疫调节剂[21,22]。3.1. 褪黑素的抗炎/免疫调节活性T淋巴细胞是人类免疫系统中最进化的细胞。 T辅助淋巴细胞（Th）（CD4 +）细胞通常包括Th1，Th2和Th17（CD4 + CD17 +）细胞和调节性T（Treg）（CD4 + CD25 +）细胞。相对于Treg细胞，Th1，Th2和Th17细胞被称为效应T细胞[23]。尽管免疫系统非常复杂，但其功能的基础基本上基于三个主要的T淋巴细胞亚群，即Th1，Treg和T17淋巴细胞。Th细胞通过诱导自然杀伤（NK）细胞进化为淋巴因子激活的杀伤细胞[27-29]来激活T reg淋巴细胞[24]，抑制Th17细胞[25,26]并促进抗原非依赖性细胞毒性。 Th细胞最重要的作用是通过分泌IL-2（T淋巴细胞的主要生长因子）来完成的[27,30]。这三个主要的T淋巴细胞亚群之间发生的关系构成了人类主要系统疾病的主要生物标志物，包括癌症，自身免疫性疾病和感染。三个相关比率包括Th1-Treg细胞比率（Th1 / Treg R），Th17-Treg细胞比率（Th17/ T regR）和Th1-Th17细胞比率（Th1 / Th17 R）。异常低的Th1 / Treg比值是晚期肿瘤的主要特征，取决于Th1细胞数的减少与Treg细胞数的增加[31]。自身免疫性疾病的主要特征是由于Th17细胞的增加和Threg细胞的下降所致的Th17 / TregR的增加[26]，Th17细胞的作用抑制了它们的生长[26]。 Th17/ Treg R的这种增加也发生在冠状病毒引起的急性呼吸窘迫综合征中[32,33]。SARS-CoV-2感染的主要病理生理学涉及中性粒细胞，巨噬细胞和肥大细胞的激活（“细胞因子风暴”）引起的促炎性细胞因子的急剧上调。它包括白介素（IL）-1β，IL-6和IL-17的增加； C反应蛋白和肿瘤坏死因子（TNF）α，通常在一周内会逐渐增加内源性抗病毒细胞，CD8 + T细胞，NK细胞和γδ-T细胞的水平和活性[34] 。但是，这种抗病毒应答的活性在SARS-CoV-2感染中受损，这些抑制的细胞显示出精疲力竭的迹象，这与肿瘤微环境中观察到的免疫抑制作用经典地相关。褪黑激素通过多种途径发挥抗炎作用。其中之一是sirtuin-1，抑制巨噬细胞向促炎型的分化[35,36]。褪黑激素的抗炎作用还包括抑制NF-κB的活化[37-39]。此外，在肝脏保护和心脏保护研究中，褪黑激素刺激了Nrf2的产生[40]。炎症通常与细胞因子和趋化因子的产生升高有关。褪黑激素导致促炎性细胞因子（TNF-α，IL-1β，IL-6，L-8，IL-17）减少，抗炎性细胞因子（如IL-10）水平升高[35,41]。在SARS-CoV-2感染中，高炎症性单核细胞/巨噬细胞大量堆积在下呼吸道中，它们在确定疾病的严重程度中起关键作用。感染SARS-CoV-2病毒的单核细胞/巨噬细胞通过生成稳定低氧诱导因子1α（HIF-1α）的活性氧，将其代谢过程从线粒体氧化磷酸化重编程为胞质糖酵解以产生ATP（Warburg效应）[42] 。具有这种代谢表型的单核细胞/巨噬细胞产生更多的细胞因子，导致T细胞破坏和肺泡内膜细胞杀伤，严重加剧了COVID-19感染。褪黑素将高度促炎的糖酵解M1巨噬细胞转化为消炎的M2巨噬细胞，后者利用线粒体的氧化磷酸化作用[43]。褪黑激素的这种作用可能是通过充分证明的HIF-1α的下调来发挥的[36]。 3.2. 褪黑素的抗氧化性能在细胞质和细胞核中，褪黑激素都对自由基具有重要的抗氧化剂和清除作用，而自由基基本上独立于受体[41]。这些作用通过三种方式发挥：（a）褪黑激素是一种自由基清除剂； （b）褪黑激素被代谢成具有高抗氧化活性的化合物； （c）褪黑激素是一种间接抗氧化剂，可刺激抗氧化剂酶的合成并抑制前氧化剂酶的合成。褪黑素在防止氧化损伤和消除自由基方面被证明优于维生素C和E [44]。此外，褪黑激素可增强其他抗氧化剂的作用，例如维生素C和Trolox。褪黑素在局部缺血（与自由基无关）的条件下发挥了几种抗凋亡和细胞保护作用，这可归因于其对线粒体膜的稳定作用[45]。在炎症水平高的疾病中，褪黑激素的应用显示出令人鼓舞的结果，可大大减弱循环中的细胞因子水平。糖尿病和牙周炎[46]和严重的多发性硬化症[47]的患者对此进行了记录。此外，在炎症的急性期，在手术压力[48]，脑再灌注[49]或冠状动脉再灌注[50]期间，褪黑激素治疗可降低促炎细胞因子的水平。通常，褪黑激素的这些抗炎/免疫调节和抗氧化作用需要通过异速测定法得出的剂量远高于褪黑激素发挥计时作用的3-10 mg /天范围。异形法适用于比例随大小变化的属性，而等角线与大小的关系保持不变。体表面积而不是体重与几种哺乳动物的生物学参数密切相关，包括氧气利用率，热量消耗，基础代谢，血容量，血浆血浆蛋白和肾功能，因此被认为是在转换剂量进行翻译时使用从动物到人类[51]。异速测定法通常用于确定I期人类临床药物试验的剂量。在临床医学中，通过Allometry转换成人数据以预测儿童的药物药代动力学参数是可行的，这可以显着降低儿童使用的新药的毒性和死亡率。值得注意的是，从动物研究中得出的理论人体等效剂量（研究褪黑素的抗炎/免疫调节/抗氧化活性）比人类通常使用的剂量大2至3个数量级，即100-300 mg /天范围[52]。根据COVID-19临床报告，患有严重感染的患者发生败血症和心脏骤停的风险增加[53,54]。现有信息表明，褪黑激素的应用可以通过抑制NLRP3途径来改善败血性休克[55]。在大鼠中，褪黑激素对败血症引起的肾脏损害，败血性心肌病和肝损害具有预防作用[56-58]。在人类新生儿败血症中，褪黑激素治疗后临床结局得到了改善[59-62]。褪黑激素还据报道对患有心肌梗塞，心肌病，高血压心脏病和肺动脉高压的患者有益。在重症患者中，深度镇静会增加长期死亡率，褪黑激素的使用会减少镇静剂的使用和疼痛的发生频率，躁动和焦虑[63]，还可以改善重症监护病房患者的睡眠质量。因此，在COVID-19中使用大剂量褪黑素的基本原理不仅着重于减轻感染引起的呼吸系统疾病，而且着重于全面改善和预防可能的并发症，包括神经系统并发症[64]。 最近的一项研究确定了大剂量褪黑激素（36 mg /天每天72mg除了标准和/或经验疗法外，还分四次服用）作为辅助疗法[65]。入院的所有患者均具有流感样症状，并且胸部影像学检查显示玻璃膜混浊非常提示COVID-19肺炎。接受褪黑激素的10例患者具有年龄（> 60岁）或/和既定合并症确定的高风险特征。除嗜睡外，未观察到明显的副作用。观察到时间可用于临床改善（症状减轻，肺浸润的稳定和/或消退，促炎性标志物减少），以及机械通气的需求，住院时间和结局（死亡，恢复或恢复）的益处。放电）[65]。另一份最近的报告是根据哥伦比亚大学欧文医学中心的临床经验进行的回顾性分析，涉及用于治疗需要气管插管的COVID-19感染患者的呼吸窘迫的药物[66]。在对791名需要插管的诊断为COVID-19的患者进行了全面评估之后，褪黑激素的应用是唯一与统计学上更高的阳性临床结果相关联的药物，包括插管患者和需要机械通气的患者的生存率。截止到2020年11月23日，该论文已作为预印本发表[66]。4. 褪黑激素作为一种慢性生物制剂慢性生长期一词始于1970年代初，已被广泛用于定义一种影响人体时钟生理调节的药物，特别是能够短期或长期或预防性地恢复失调的昼夜节律的药物。避免在遭受环境攻击后将其中断[67]。相变的大小和方向取决于化合物在其中的昼夜节律相，这反过来在行为节律中产生明显的相变。例如，在早晨服用褪黑素会延迟昼夜节律的阶段，而在晚上服用会褪色昼夜节律的阶段。在一天的大部分时间里，褪黑激素的给药无法改变内源性时钟的相位（相位响应曲线）[68]。衰老与对COVID-19感染的更高脆弱性的关联是一个非常重要的主题。几个因素，包括由于社会孤立而造成的更大压力，随着年龄的增长褪黑激素水平降低以及个体在晚上没有足够的光照，这会降低褪黑激素水平并破坏昼夜节律，这对于维持老年个体的昼夜健康至关重要。在其他几种合并症中，老年人更容易受到冠状病毒感染，而衰老与更易感染COVID-19感染的关联目前是最重要的主题[33]。在社会上孤立的老年人中，压力和沮丧感的增加导致促炎性增加和抗病毒免疫反应降低。在强制锁定期间呆在室内的后果中，昼夜节律尤其是睡眠/唤醒周期的节律紊乱非常频繁，并且与年龄相关的昼夜节律不齐发展。昼夜节律系统的失调被认为与老年个体的几种医学和精神状况有关，尤其是心血管和神经退行性疾病[69,70]。诸如当前大流行期间的强制锁定会中断暴露于环境光（最重要的环境Zeitgeber）的时间和持续时间。使用手机，平板电脑和计算机观看新闻，狂欢观看网络连续剧以及在社交媒体上进行连接会导致傍晚的屏幕时间过长。屏幕发出的蓝光会抑制夜间褪黑激素的自然产生。白天的活动水平也会影响睡眠方式。 低水平的活动（无论是由于坐月子还是沮丧），对于剧烈的活动（例如，由于压力或工作负荷过大）也会对睡眠产生负面影响[71,72]。衰老通常与睡眠效率和连续性的显着降低有关，这与褪黑激素节律幅度的显着降低相吻合，因此也与许多其他昼夜节律有关[73]。老年人中经常报告清晨觉醒的增加和入睡的困难。褪黑素分泌受损与老年人失眠症中遇到的睡眠障碍有关。的确，衰老可能是褪黑激素缺乏引起的相对昼夜节律失调所导致或加重的过程。褪黑素通过公认的生长期能力，可以有效改善老年人的生活质量[74]。衰老期间睡眠障碍的常见原因包括但不限于生活方式（例如退休生活），既往的医学和精神疾病，多药店，不良的睡眠习惯，既往的睡眠障碍和心理困扰[75] 。睡眠功能障碍和睡眠障碍在老年人口中非常普遍[71]。如上所述，在COVID-19大流行期间，睡眠中断变得更加普遍。计时疗法的目的是在考虑人体的昼夜节律的情况下优化药物治疗[76,77]。计时疗法通过两种方式起作用：（a）它改变患者的睡眠/苏醒节律，以改善几种病理的后遗症； （b）通过评估患者的昼夜节律可以改善治疗时机。两种方法都与COVID-19大流行期间老年患者实施计时疗法策略有关。即使是生物钟的轻微功能障碍，也会极大地影响睡眠/苏醒生理，导致过多的昼夜嗜睡，睡眠发作潜伏期增加，阶段延迟或睡眠发作进展，频繁的夜间觉醒，睡眠效率降低，快速眼动睡眠的延迟和缩短，或腿部周期性运动增加[78]。计时疗法旨在通过适当的睡眠卫生，定时的光照以及使用褪黑激素这样的生长期药物来恢复老年人的适当的昼夜节律，从而影响昼夜节律的输出阶段。节奏，从而控制时钟[79]。关于计时疗法的第二个基础，应该强调的是免疫系统具有很强的昼夜节律性[80]。在日常活动开始时，促炎性介质（如白介素（IL）-1β，IL-6和IL-12）以及巨噬细胞和白细胞活性的表达增加，从而导致对组织的潜在损害。相比之下，抗炎介质和其他生长或血管生成因子在静止期达到峰值（例如，参见[81]）。在静止阶段，针对病毒抗原的CD4 +和CD8 + T细胞活性均达到最高水平，而自然杀伤细胞的细胞毒性活性在一天的活跃部分开始时最为严重。实际上，一天中发生病毒感染的时间会影响生存。例如感染在活动阶段开始时，比在休息阶段开始时发生的感染更具致命性[82]。这些时间模式在老年人中可能会受到干扰，因此在老年人群中使用免疫调节剂和抗炎药时应考虑昼夜节律紊乱[81]。合理的昼夜节律性抗炎药（计时疗法）可以针对COVID-19患者中有害的炎性级联反应，而不会干扰免疫系统对抗病毒的作用。这对于低剂量地塞米松治疗可能非常重要，因为最近的研究表明它可以将严重感染的COVID-19患者的死亡率降低到三分之一[83]。接受机械通气的高达50％的住院老年患者和80％的重症患者发现妄[84]。用褪黑激素治疗这种经时破裂与缩短重症监护病房住院时间，减少ir妄发生率和改善睡眠质量有关[85]。在COVID-19疾病中，大约15％的住院患者意识受损，范围从嗜睡到神志不清，ir妄，木僵和昏迷[86]。褪黑激素应被视为有效改善睡眠的药物，并有可能最大程度地减少服用苯二氮卓类药物或抗精神病药可能会使老年人或患有中枢性呼吸抑制的人的ir妄恶化[87]。5. 褪黑素和细胞保护糖尿病，代谢综合症以及缺血性和非缺血性心血管疾病是加重COVID-19疾病的合并症。代谢综合征的患病率在15％到30％之间变化，具体取决于所考虑的地区，当存在代谢综合征时，心血管死亡率会增加1.5到2.5倍[88,89]。据美国疾病控制与预防中心报道，据估计，患有2型糖尿病后发生代谢综合症的人死于COVID-19的风险可能高达10倍[90]。根据COVID-19患者的病情轻重，确诊的COVID-19病例中确定的心血管合并症数量在4.2％至40％之间，并且在疾病过程中急性心脏损伤的发生率在12％至23％之间。调查[91]。因此，对这些疾病的充分控制是在正在进行的大流行中实现的主要目标。在人类中，糖尿病，代谢综合征，缺血性和非缺血性心血管疾病中循环褪黑激素水平持续降低，并且通过有限数量的临床试验表明褪黑激素的治疗价值，这些临床试验通常以2-5 mg /日范围[92,93]。在代谢综合征，缺血性和非缺血性心血管疾病的动物模型研究中，褪黑激素在减少症状方面非常有效[52]。人体中几乎每个细胞都含有褪黑激素，其含量远高于从松果体的血液中循环的褪黑素[94]。现已证实线粒体合成褪黑激素的能力，但由于无法解释的原因，细胞内褪黑激素不会进入细胞外空间。要改变细胞内褪黑激素的水平，需要的剂量要比用作生时激素的剂量高得多[95]。此外，从动物研究得出的异速计算表明，预期的人类褪黑激素细胞保护剂量为40-100 mg /天，在临床实践中很少使用。 褪黑激素能否成为治疗COVID-19患者的潜在“银弹”？（下）点击查看： 更多医学类文章 免费试用文档翻译功能免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网站无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。来源于：mdpi