案例报告

YousefAl Zoubi1,2，Bashair M.Mussa 2，*，Ankita Srivastava 1，Abdul Khader Mohammed 1，Elamin Abdelgadir 3，Alaaeldin Bashier 3，FatheyaAl Awadi 3和Salah Abusnana 4,5

1. 沙迦大学医学研究所沙迦，阿联酋沙迦27272； u19105816@sharjah.ac.ae（Y.A.Z.）; ankita2112@gmaicom（A.S.）; amohammed@sharjah.ac.ae（A.K.M.）

2. 沙迦大学医学院基础医学系，阿联酋沙迦27272

3. 迪拜卫生局，迪拜医院，阿联酋迪拜4545； alaminibrahim@hotmail.com（E.A.）; alaaeldin11@gmail.com（A.B.）;alawadi1122@hotmail.com（F.A.A.）

4. 阿联酋沙迦大学附属医院糖尿病和内分泌科，阿联酋沙迦72772；

萨拉赫.阿不思娜娜@UHS.啊哦

5. 沙迦大学医学院临床科学系，阿联酋沙迦27272

 * 通讯：bmussa@sharjah.ac.ae；电话：+ 971-65057220

摘要：降血糖事件的复发导致下丘脑控制的正常反调节机制减弱，从而导致低血糖意识不足（HU）。在本病例报告中，我们首次描述了从一名27岁1型糖尿病患者的血液样本中TNF-α，IL-1β，IL-6和IFN-γ的差异表达被诊断患有HU的糖尿病（T1DM）。该抗糖尿病方案目前基于胰岛素注射，但患者正计划开始使用胰岛素泵以更好地控制葡萄糖水平。我们的结果表明，T1DM合并HU的患者中IL-1β，IL-6和IFN-γ的表达有增加的趋势。然而，TNF-α的mRNA水平显示出显着降低。这些观察结果表明全身性炎症可能是HU的根本原因。

关键字：低血糖意识；1型糖尿病；细胞因子炎性标记TNF-α; IL-1β； IL-6；干扰素

1. 介绍

葡萄糖是大脑的主要能源，可用于促进一些关键过程，例如认知功能[1,2]。低水平的葡萄糖会触发反调节反应（CRR）的激活，该反应主要涉及肾上腺素的释放[3]。下丘脑中的葡萄糖敏感神经元致敏后，交感神经系统介导肾上腺髓质中肾上腺素的分泌[4-6]。

医源性降血糖发作的复发经验会导致CRR紊乱，这被称为低血糖相关的自主神经功能衰竭（HAAF）[5,7,8]。后者主要是由于在1型糖尿病（TIDM）患者中使用抗糖尿病药物，尤其是基于胰岛素的治疗引起的[9]。 CCR功能失调的主要结果是肾上腺素对低血糖反应迟钝，进而导致人们对低血糖症一无所知[10]。低血糖无意识（HU）是由于无应对低血糖的自主神经警告症状而出现无症状性低血糖的情况[7]。尽管复发性降血糖发作是导致HAAF的主要原因，但其机制尚不清楚。

我们建议低水平的葡萄糖是神经炎症的病因候选物，并且对下丘脑神经元的存活产生不利影响，最终导致到HU。先前的研究通过显示低水平的葡萄糖在糖尿病患者中引起炎症反应来支持这一假设[11]。在此，我们报告一例被诊断患有HU的T1DM患者，我们旨在调查炎症与HU之间的关系（如果有）。

2.案例描述

2.1.低血糖意识不足（HU）患者

自2014年以来，一名27岁的女性被诊断患有T1DM已有8年，其反复出现严重的低血糖和HU。该患者被送至诊所，体重为56公斤，体重指数（BMI）为22.43千克/平方米。该患者的最新空腹血糖和HbA1c分别为258 mg/dl和7.8％。她经常在晚上和不吃午餐时经历无症状的低血糖症。除了对HU的诊断外，她两年前还被诊断出维生素D缺乏症。由于持续使用胰岛素注射剂，她的手臂和大腿有轻度的脂肪肥大。尚未报告与当前状况有关的家族史。

2.2.当前和将来的治疗干预

该患者目前正在接受超长效胰岛素和速效胰岛素治疗的联合治疗。她每天晚上服用22 U /天的胰岛素地高铁，每天服用总共36 U /天的赖脯胰岛素，分为三剂，早餐前10 U，午餐12 U，晚餐14U。此外，由于维生素D缺乏症，她每天需要服用1片50,000 U胆钙化固醇。未来的管理计划包括使用胰岛素泵以更好地控制血糖。

2.3.血样采集和炎性生物标志物评估

从HU患者和其他两个受试者中采集了5 mL血液样本：BMI为21.16 kg / m2的30岁T1DM患者和没有糖尿病或任何其他疾病的24岁健康人。本研究是在沙迦大学医院（UHS），迪拜医院（DH）和沙迦医学研究所（沙迦大学，UOS）进行的。该研究获得了UHS伦理委员会（UHSREC042018，2018年4月），卫生署（DSREC-09 / 2018_13，2018年10月）和UOS（REC-17-08-0801，2017年11月）的伦理委员会的批准并进行根据赫尔辛基宣言。要求所有参与者签署以他们的母语写的知情同意书。

按照制造商的规程，使用QIAamp RNA Blood Mini Kit（Qiagen，Hilden，德国）从全血中提取总RNA。然后，通过Nanodrop2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）对分离的RNA进行定量，并通过A260 / A280的比值确定纯度。然后使用高容量cDNA合成试剂盒（美国加利福尼亚州福斯特城的Applied Biosystems）将RNA反转录为1000 ng / mL cDNA。

使用QuantStudio 3实时PCR（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）系统进行定量促炎细胞因子基因表达的定量实时PCR（qRT-PCR）实验，总反应量为10 µL包含5 µL 1PowerSYBR 绿色预混液（AppliedBiosystems，FosterCity，CA，美国），1 µL10 µM正向和反向引物（表1），1 µL NFW和2 µL cDNA。循环参数包括在95℃下初始化2分钟，然后在95℃下变性15 s，然后在60℃下退火1分钟，并在60℃下延伸60℃。

1分钟，共40个循环。相对基因表达采用2（∆ΔCt）方法确定，甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）被用作看家基因。表1列出了用于特异性扩增TNF-α，IL-1β，IL-6，IFN-γ和GAPDH的人引物序列。用NFW代替cDNA实施的样品被视为阴性对照。

表1.用于定量实时聚合酶链反应的人类引物。

2.4.T1DM和HU中炎症标志物的基因表达

在qRT-PCR实验中，我们旨在比较T1DM合并HU的患者，无HU合并T1DM的患者以及健康受试者的血液样本中四种细胞因子的mRNA表达。如图1A所示，与健康受试者（对照组）相比，没有HU的T1DM患者和患有HU的T1DM患者的TNF-α表达显着增加，而在没有HU的T1DM患者中，TNF-α表达显着升高。与没有HU的T1DM相比，没有HU的T1DM。

图1.有和没有HU的TIDM患者中炎症标志物的差异基因表达。（A，B，C和D）分别显示健康，没有HUMAN的TIDM和带有HUMAN的TIDM中TNF-α，IL-1β，IL-6和IFN-γ的表达（**** p <0.0001，*** p<0.001，** p <0.01，* p <0.05）。缩写；HU，低血糖意识不足； ns，无统计学意义；无HU，无低血糖意识；w HU，对低血糖症一无所知。

与TNF-α不同，与没有HU的T1DM患者相比，患有T1DM和HU的患者IL-1β表达增加。但是，这种差异在统计学上并不显着（图1B）。与对照组相比，在患有和不患有HU的TIDM患者中，IL-1β的表达均显着较高。

在IL-6的表达中观察到类似的模式，在有或没有HU的T1DM患者中，IL-6的表达明显高于对照组。此外，与没有HU的患者相比，在HU的患者中观察到IL-6的表达呈上升趋势，但此结果在统计学上不显着（图1C）。

如图1D所示，与健康对照组相比，有和没有HU的T1DM患者中IFN-γ的表达均得到了显着提高。

尽管与没有HU的T1DM的患者相比，TIDM和HU的患者中IFN-γ的表达有增加的趋势，但这种增加没有统计学意义。

3.讨论区

HU是一种非常具有挑战性的医学疾病，患者会失去识别低血糖发作的能力，这会增加出现严重后果（例如昏迷）的风险[12]。 HU的发病机理尚待阐明。然而，先前的研究表明低血糖与炎症之间存在联系[12-14]。本报告旨在调查HU与全身性炎症之间的关系（如果有）。我们已经证明，患有HU的T1DM患者的TNF-αmRNA水平约为没有HU的患者的一半。这一发现可能与一些研究相反，这些研究表明，与血糖正常的患者相比，T1DM患者在低血糖期间TNF-α血浆水平升高[15]。但是，这可以由以下事实解释：本报告仅包括一例HU。此外，以前的报告仅调查了与HU不同的低血糖病例。后者涉及低血糖的反复发作，从而导致下丘脑神经功能的操纵。另一方面，以前的研究表明，与其他细胞因子相比，神经系统疾病表现出TNF-α的不同功能作用，这反映了TNF-α对大脑网络的独特影响。已发现更长的TNF-α表达持续时间对于产生该试剂对神经元的不利作用是必需的。这可能为我们的报告[16]中的TNF-α差异表达提供了另一种解释。

患有HU的T1DM患者的血液样本中的IL-1βmRNA显示较高水平高于没有HU的T1DM患者。这可能与Nematollahi等人的观点一致。研究表明，健康受试者在胰岛素诱导的低血糖后，IL-1β水平升高[12]。此外，在患有低血糖意识受损的T1DM患者中，IL-6的mRNA表达水平也比有意识的患者更高

低血糖症。IL-6是与低血糖相关的最常研究的细胞因子之一。先前的研究表明，高IL-6血浆水平与频繁的低血糖发作有关[17]。最后，对IFN-γ的研究被认为是本研究的新颖方面之一，因为先前的研究均未包括与HU有关的该药物。本报告

已经发现与没有HU的患者相比，HU的患者的IFN-γmRNA水平升高。但是，没有统计学意义。尽管目前尚无研究表明低血糖与IFN-γ之间存在任何关系，但已发现IFN-γ破坏了糖尿病脑中大脑的免疫细胞[18]。有趣的是，最近的研究表明，IFN-γ代表糖尿病与痴呆等神经退行性疾病之间的联系[19]。因此，在本研究和我们的未来研究中将IFN-γ包括在内将引起极大的兴趣。

我们报告中的主题数量可以视为该研究的主要局限性。在所有招募的T1DM患者中，仅发现一名确诊为HU的患者。在未来的研究中，可以通过使用多中心方法增加样本量来改善这一点。

该病例报告的结果表明，假设后者是HU的根本原因，则表明HU与炎症之间存在关系。我们的结果显示，T1DM患者中IL-1β，IL-6和IFN-γ的表达有增加的趋势。然而，TNF-α的mRNA水平显示出显着降低。这些观察结果表明，全身性炎症可能是HU的根本原因。

因此，未来需要功能强大且严格的对照研究来进一步评估下丘脑炎症在HU病理生理中的作用。

作者贡献：Y.A.Z.和B.M.M.构思并设计了研究。 Y.A.Z.和A.K.M.进行了实验和数据分析。 B.M.M.解释了结果。 Y.A.Z.起草了手稿。 E.A.，A.B.，F.A.A. S.A.筛选了患者并修改了手稿。 B.M.M.和

    参考文献

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