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干细胞疗法治疗肝病

干细胞疗法治疗肝病

医学 生物学 文献翻译
407
2021-01-14 19:17:26

 

克拉拉·尼古拉斯(ClaraNicolas)1,*,王玉佳(Jiang Wang)1,珍妮弗·吕布·惠勒(Jennifer Luebke-Wheeler)1和斯科特·尼伯格(Scott L.Nyberg)1,2

收到:2015年11月25日;接受:2015年12月31日;发布时间:2016年1月6日学术编辑:邓文斌

1 William J. von Liebig移植和临床再生中心,梅奥诊所,罗切斯特,MN 55905,美国; wang.yujia@mayo.edu(Y.W.); luebke-wheeler.jennifer@mayo.edu(J.L.-W.); nyberg.scott@mayo.edu(S.L.N.)

2 美国罗切斯特市梅奥诊所外科科,美国明尼苏达州55905

 

摘要:胞疗法是几种肝脏疾病的新兴治疗形式,但受到供体肝脏可用性的限制。干细胞有望替代原代肝细胞。我们对文献进行了详尽的回顾,重点是涉及使用干细胞治疗肝病的最新研究。干细胞可以从多种来源中收获,或者可以从体细胞中产生以产生诱导性多能干细胞(iPSC)。实验上已经使用了不同的细胞系来支持肝功能,并治疗遗传性代谢异常,急性肝衰竭,肝硬化,肝癌和小型肝移植。基于细胞的疗法可能涉及基因疗法,细胞移植,生物人工肝装置或生物工程器官。该领域的研究仍然非常活跃。将来,干细胞疗法可被用作肝移植或内源性肝再生的桥梁,但是必须开发有效的分化和生产方案,并且必须证明其安全性,然后才能将其应用于临床实践。

关键词:干细胞;肝病;诱导多能干细胞;基因校正细胞移植生物人工肝再生医学细胞疗法


1. 介绍

迄今为止,肝移植是治疗药物难以治疗的多种肝病的唯一有效方法。不幸的是,对供体器官的需求大大超过了其供应,因此有必要替代全器官肝移植进行治疗。针对可移植肝脏的短缺,已经出现了细胞疗法。已经评估了离体肝脏支持疗法和体内细胞移植,并显示了治疗肝衰竭的潜力。肝脏由于其内源性的再生和修复能力强,因此特别适合这种疗法[1-3]。

分离的原代肝细胞是体内和离体细胞疗法中要测试的第一类细胞,但是它们的使用受到许多尚待克服的技术难题的限制。肝细胞在体外培养中不能长期存活[4],因为(1)体外生长能力极低[5],(2)肝特异性基因的表达在体外迅速下降[6]和(3)易冻性融化的破坏使冷冻保存变得复杂[7]。然而,使用它们的主要限制是由于供体肝脏的缺乏,无法分离出高质量的原代肝细胞,因此无法满足临床对肝细胞的需求。

随着再生医学的到来,肝细胞治疗的重点已经稍微转移到干细胞的治疗潜力上,这是一种在组织损伤后恢复正常结构和功能的手段。干细胞的分化和自我更新能力使其成为无数肝细胞生成的合理来源。因此,干细胞疗法可以替代

全器官肝移植在治疗肝脏疾病方面具有广阔的前景。几种类型的干细胞已被证明适用于肝细胞置换。在这篇综述中,我们探讨了每种细胞系的优势和局限性,以及可能从干细胞疗法中受益的各种肝脏疾病。

 

2. 干细胞来源用于肝病治疗

2.1. 肝干细胞

干细胞可以从成年或胎儿肝脏获得。成人肝干细胞(也称为卵圆细胞)和胎儿肝干细胞(称为成肝细胞)都是双能的,因此能够分化为肝细胞或胆管细胞[8-10]。已经证明,当肝细胞的复制能力受损时,卵形细胞会在肝再生中发挥作用[11],而在动物模型中,已通过实验将成肝细胞用于肝再生[12,13]。人成肝细胞也已被培养,并已显示出移植到免疫缺陷小鼠体内后在体内的植入和分化[14]。

使用肝源性干细胞的主要限制是正常肝中它们的数量非常低,卵圆形细胞仅占成年肝的0.3%至0.7%[15],而成肝细胞仅占成年肝的不到0.1%。胎儿肝脏肿块[16]。这使得它们的隔离和扩展具有挑战性,从而限制了其在小规模使用中的应用。

2.2. 骨髓干细胞

骨髓干细胞包括造血干细胞和间充质干细胞(MSC)[17]。 MSC是在骨髓和其他成年器官和组织(例如脂肪组织)中发现的多能祖细胞,它们很容易获得,并且可以在培养物中快速扩增[18,19]。

在这两个细胞群中,已建议MSC具有更高的肝再生潜力[20]。此外,它们比造血干细胞具有另一个优势:它们具有免疫调节或免疫抑制特性,可下调T细胞,B细胞和NK细胞的功能[21]。在临床上,这可以转化为肝移植后诱导耐受的能力。

2.3. 附件干细胞

附件干细胞是容易获得的细胞,其衍生自人胎盘组织,脐带和脐带血以及羊水。它们是多能的,因此与成体干细胞相比,它们具有更高的分化潜能,并且具有更高的增殖率[22-24]。附件干细胞还提供了另一个优势:尚未描述它们可在人类中形成畸胎瘤或畸胎瘤。在一项研究中,急性毒性肝损伤后向非肥胖型严重合并免疫缺陷小鼠腹膜内施用人脐带血干细胞显示出快速的肝移植,分化为肝细胞,改善了肝的再生并降低了死亡率[25]。

2.4. 胚胎干细胞(ESC)

ESC是全能细胞,可以分化为类肝细胞,具有损伤后能够在肝脏中定植的能力,并且具有与成熟肝细胞相似的功能[26]。但是,使用ESC有两个主要限制。首先,它们的采购涉及胚胎的破坏这一事实引起了道德上的担忧,这些担忧抑制了ESC研究的进展[27]。其次,ESC移植的供体和受体之间存在免疫不相容的问题[28]。尽管如此,ESC的研究仍在进行中,最近的一项研究揭示了一种分化为新生儿肝细胞的有效方案,该新生儿肝细胞能够在体内无肿瘤诱导地繁殖肝脏,并在对乙酰氨基酚引起的毒性小鼠中拯救肝脏功能[29]

 

2.5. 诱导多能干细胞(iPSC

iPSC具有与ESC相似的特性,包括多能性和自我更新,但避开了使用此类细胞固有的主要问题。 iPSCs是由体细胞在体外产生的,无需使用胚胎组织或卵母细胞,从而避免了伦理争议[30]。此外,它们提供了自体使用的可能性,解决了异体排斥的问题。 2006年首次描述的iPSC的使用已迅速发展为胚胎干细胞的有前途的替代方法,但在考虑将其应用于临床之前,必须解决几个问题,并且必须确定它们与ESC的等效性[ 32]。图1显示了iPSC和ESC之间的生产差异。

 

胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的产生.png

1.胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的产生。


          iPSC可能来自多种细胞来源,并且有人提出,它们的起源可能在它们的分化能力中发挥作用[33,34]。尽管成纤维细胞是人类iPSC(hiPSC)的最常见来源,但这些细胞也已成功地从多种其他体细胞类型(包括原代肝细胞)中重新编程[35]。然而,已经有人提出,与其他来源的细胞相比,肝细胞来源的细胞系对畸胎瘤形成的倾向可能更高。有证据表明,由于hiPSC系的表观遗传记忆力会随着时间的流逝而丢失,因此可以从多种来源的iPSC成功诱导肝分化[37]。实际上,研究表明,可预测的iPSC分化与体细胞来源无关,而是在很大程度上取决于所使用的重编程策略[39]。其他作者建议,相反地,iPSCs具有偏斜的分化潜能,这源于它们的谱系特异性表观遗传记忆,使它们易于分化为起源的细胞类型[40]。需要进一步的研究来阐明这一点,并找到最合适的细胞来源来产生能分化为肝细胞的hiPSC。还存在对iPSC进行重编程的不同方法,有关iPSC生成的第一份报告是由逆转录病毒载体组成的,用于诱导多能性。该方法受到病毒转基因自发再激活及其整合入宿主基因组的可能性的限制,这转化为形成肿瘤的风险[41]。但是,在过去两年中,成功解决了iPSC生成问题。例如,hiPSC现在可以由不整合到靶细胞基因组中的载体产生[42,43],甚至可以由小分子化合物诱导[44,45]。

迄今为止,尚未从iPSC或ESC获得体外完全成熟的肝细胞。

获得的称为肝细胞样细胞(HLCs)的细胞具有原代肝细胞的大部分特性,但功能上并不成熟,如其较低的白蛋白生成水平,CYP活性和尿素循环活性以及通过它们持续表达高水平的甲胎蛋白[46]。已经开发出许多分化方案[47-49],并且通过三步方案将分化时间从平均超过20天减少到12天,从而提高了其效率[50,51]。 Asgari等。 [52]将hiPSC衍生的HLC表征为表达肝细胞特异性标志物,糖原和脂质存储活性,白蛋白分泌和CYP450代谢活性,并且在移植后,这些细胞具有改善CCl4损伤的小鼠肝脏功能状态的能力[ 52]。最新研究集中在将成纤维细胞直接谱系重编程为人诱导的肝细胞,已产生具有药物代谢功能的功能性和可扩展性细胞[53,54]。尽管如此,分化方案必须在临床应用可行之前进行优化,因为已经表明完全分化的细胞移植后具有较低的畸胎瘤形成风险[55]。必须消除残留的未分化细胞,不仅避免畸胎瘤的形成,而且避免对多能性抗原产生免疫反应的可能性[56]。此外,分化后必须仔细研究目的细胞类型的免疫学特性[57,58]。

必须克服的另一个障碍是缺乏高效,大规模的hiPSC生产系统,因为单层静态组织培养物将无法维持临床应用所需的快速细胞扩增。在这方面已经取得了进展,iPSC培养物以3D悬浮液的形式聚集[59]。 3D培养的优势是可以高密度培养hiPSC [60],同时可以增加HLC向成年表型的功能成熟度,并提高其功能寿命[61]。

尽管有这些挫折,但仍取得了令人鼓舞的结果。朱等。 [62]能够通过缩短重编程规程以避免多能性,通过诱导多能祖细胞(iMPC)而不是iPSC来区分人成纤维细胞中的肝细胞[62]。然后,他们在人肝衰竭的免疫缺陷小鼠模型中实现了肝脏再填充,其肝细胞功能水平与人成年原代肝细胞相似。此外,通过阻止细胞进入多能状态,很可能防止了肿瘤的形成。已经发现,不涉及基因组整合的重编程方法以及通过在重编程过程中去除c-Myc均可降低iPSCs的致瘤性和免疫原性[64]。关于iPSCs的致癌潜力,最近在恒河猴中进行了自体畸胎瘤形成试验,得出的结论是,虽然未分化的自体iPSC形成畸胎瘤,但iPSC衍生的祖细胞在体内产生功能组织而没有肿瘤迹象形成[65]。此外,未分化细胞形成的畸胎瘤的生长效率比同等啮齿动物模型低至少20倍,这可能是由于完整的免疫和炎症系统的存在所致。它与人类生理学的相似性使这种非人类灵长类动物模型对于基于iPSC的疗法的研究非常有价值。

          iPS细胞进行了研究,已经在许多不同的肝脏疾病的背景下对iPSC进行了研究,但是iPSC的最直接用途可能是人类肝脏疾病的建模和体外药物测试[66,67]。

3. 干细胞用于肝病治疗的技

干细胞向HLC的分化可以在使用前在体外实现,也可以在细胞移植后在体内实现。体外培养和分化正在广泛研究中,并且仍在创造新的,更有效的方案。但是,干细胞在注射后也具有体内分化为HLC的能力。不同细胞系都是如此。在一项研究中,静脉注射纯化的造血干细胞显示出在富马酰乙酰乙酸水解酶(FAH)基因敲除小鼠体内向HLC分化,从而恢复了肝功能[68]。 FAH´ {´小鼠是I型酪氨酸血症的动物模型,在研究代谢性肝病的再生疗法方面具有巨大潜力。在这些动物中,非FAH缺陷型野生型细胞由于具有选择性优势,可以在移植后大量繁殖肝脏。当FAH基因敲除与免疫缺陷等位基因结合时,人类细胞可用于重新填充肝脏,形成嵌合器官[69]。为了提供更具临床意义的动物模型,还创建了FAH´ {'猪,可用于测试不同细胞疗法的功效[70]。此外,如果可以在这些动物中充分实现肝脏人源化,则可以将它们用作活体生物反应器,以生产大量功能性人肝细胞。图2显示了FAH基因敲除猪的创建及其作为原代人肝细胞培养箱的可能用途。

 

用人类肝细胞填充FAH缺陷型猪肝。尼替农(NTBC)用于治疗FAH缺乏的动物,同时发生肝细胞移植和增殖。.png

2.用人类肝细胞填充FAH缺陷型猪肝。尼替农(NTBC)用于治疗FAH缺乏的动物,同时发生肝细胞移植和增殖。 

其他细胞系,例如小鼠ESC和人类骨髓来源的MSC,也已被证明可以在体内分化为HLC [71,72]。尽管如此,在考虑临床应用之前,必须更深入地研究体外和体内信号模式,分化机制和最佳增殖条件,尤其是因为数据表明成熟肝细胞的移植和再繁殖能力要比干细胞高。 [73]

4. 干细胞在肝脏疾病中的潜在应用

4.1. 遗传性肝病

遗传性肝病中的细胞疗法不仅可以充当肝移植的桥梁,而且还为长期纠正代谢缺乏症提供了机会[74]。原代肝细胞移植已用于治疗人类的多种疾病,包括家族性高胆固醇血症,1型Crigler-Najjar综合征和尿素循环缺陷等[75]。同时患有Crigler-Najjar 1型和尿素循环缺陷的患者正在接受I期临床试验,以治疗由正常成人肝脏组织产生的异源人类成人肝脏祖细胞悬浮液[76]。但是,如前所述,供体器官不足,无法从中分离出高质量的肝细胞,必须考虑同种异体排斥的可能性。自体移植可以避免同种异体排斥,但是只能通过肝切除获得足够数量的自体原代肝细胞。可以通过使用iPSC来避免此问题。

随着干细胞技术的发展,尤其是iPSC的发展,遗传性肝病的治疗可以进一步向前:通过将基因校正技术与自体细胞移植相结合,可以创建针对患者的治疗方法[77,78]。无病的自体hiPSC首先通过离体基因治疗产生[79],然后经过基因校正的hiPSC分化并用于移植。图3显示了如何将hiPSC与基因校正和分化技术结合起来以生产自体,无病的肝细胞进行移植。

 

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图3. iPSC的基因校正,用于产生患者特异性无病肝细胞。 

 

       从理论上讲,这种方法可以应用于任何已知潜在突变的遗传性疾病,并且已经在造血疾病的动物模型上进行了测试,结果令人鼓舞[80]。在hiPSC中,α1-抗胰蛋白酶的缺陷也得到了基因纠正,从而在在小鼠的体内和体内分化的HLC中恢复了蛋白质的功能,[81]。家族性高胆固醇血症患者的hiPSC也已成功产生了经过疾病校正的HLC [82]。根据这些研究,自体基因校正的hiPSC衍生的肝细胞的移植显示出治疗遗传性肝病的希望。可以在4到5个月内获得针对患者的无病hiPSC系列产品[83]。另外,hiPSC可以用于遗传性代谢疾病的建模和研究[51]。

4.2. 急性肝衰竭(ALF)

如前所述,肝脏具有相当大的内源性再生能力[84]。当它遭受急性损伤时,修复机制就会生效,在许多情况下,修复机制将能够随着时间的推移恢复功能正常的存活肝[85],但是在再生过程中必须支持肝功能[86]。已经尝试了两种不同的方式:通过细胞移植或通过生物人工肝(BAL)系统。

细胞移植可以为ALF或慢性慢性肝功能衰竭提供临时解决方案。 Pareja等。 [87]在急性慢性慢性肝衰竭患者中进行了肝细胞移植,取得了令人鼓舞的结果,包括改善高氨血症和脑病程度[87]。同样,永生化的人类胎儿肝细胞的移植显着提高了90%肝切除术后小鼠的存活率[88]。肝细胞与骨髓间充质干细胞的共包封不仅增加了移植[89],延长了肝细胞的生存能力,而且还增强了其在体内和体外的肝细胞特异性功能[90]。当单独移植时,骨髓来源的MSC可减轻小鼠的肝损伤并抑制肝内NK细胞活性[91,92]。此外,有证据表明,仅由MSC条件培养基产生的免疫调节就足以消除对供体肝细胞的需求[93]。 MSC衍生的外泌体也已被证明可以激活再生反应,从而在CCl4损伤的小鼠中导致增殖蛋白的更高表达[94]。与基于细胞的疗法相比,这些疗法的优势在于它们不太可能触发免疫反应。关于iPSC,Chen等。 [50]证明,在应用其三步分化方案后,iPSC衍生的HLC在严重的联合免疫缺陷小鼠模型中挽救了致命的暴发性肝衰竭[50]。

BAL的另一种有希望的治疗方法是BAL,BAL是一种体外支持疗法,可以在执行活性肝细胞的生物转化和合成功能的同时去除毒素[95]。该系统旨在桥接ALF患者,使其通过再生来恢复天然肝脏或进行肝移植[96]。第一个被批准用于II / III期试验的BAL是基于猪肝细胞的装置,该装置在ALF患者的一项前瞻性,随机对照试验中进行了评估。对暴发性或亚暴发性肝功能衰竭患者进行亚组分析可提高生存率,但未达到整个研究人群生存的主要终点[97]。

尽管原代猪肝细胞是BAL试验最常用的细胞来源[98],但永生化的C3A人肝母细胞瘤细胞也已在体外肝辅助装置(ELAD)中进行了试验[99],尽管尚无随机对照试验显示生存获益日期和荟萃分析结果尚无定论[100,101]。 HepaRG细胞是人类肝双能祖细胞系[102],能够在暴露于二甲基亚砜(DMSO)[103]后分化为肝细胞簇和周围的胆管上皮样细胞[103],目前正在阿姆斯特丹医疗中心进行BAL应用的评估(AMC)生物反应器,结果不一[104,105]。与无细胞BAL治疗相比,HepaRG-AMC-BAL已显示增加了ALF大鼠的存活时间[106]。


为了成功地将BAL用于临床,似乎每种治疗方法至少必须可使用200 g功能性肝细胞。由于这个原因,由于原发性人类肝细胞的可用性有限以及它们在体外的短功能性和生存力,目前尚不实用。这些问题已通过使用肝细胞球体解决,该球体可保护细胞免于凋亡,并允许在治疗期间使用更大的细胞量[ 107 ]。猪肝细胞的使用也受到异种性和xenozoonosis的限制,而永生化细胞系的使用受到其基本细胞功能的丧失(如尿素循环和CYP酶活性)的限制[ 108]。因此,ESC和iPSC有望成为BAL设备的细胞来源。Soto-Gutierrez等。[ 109 ]显示,在90%肝切除的小鼠中,用皮下植入的BAL植入ESC衍生的HLC来治疗ALF可改善其肝功能,并延长其生存期[ 109 ]。iPSC的初步研究还表明,在生物反应器模块中培养7天后,这些细胞分化为HLC [ 110 ]。

          时间限制是使用干细胞治疗ALF的主要限制之一。ALF疗法需要快速且有效地产生大量细胞,因此按照当前方案,培养和分化自体细胞所需的时间可能是禁止的,这使得同种异体肝细胞成为更实际的选择。一旦建立了有效且快速的分化为HLC的方案,使用HLA / MHC与HLA / MHC密切匹配的iPSC库是一项需要进一步研究的选择[ 108 ]。


 

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来源于:mdpi

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