来源于：MDPI

国家理工学院-CNMN，墨西哥城萨卡特科上校Adolfo López Mateos专业单位，墨西哥CDMX CP 07738； darrieta@ipn.mx（D.A.-B.）; mpereaf@ipn.mx（M.d.J.P.F.）； jmendezm@ipn.mx（J.V.M.-M.）;hfmendoza@ipn.mx（H.F.M.L.）

收到：2020年11月30日;接受：2020年12月14日;发布时间：2020年12月16日

摘要：角质层是几乎所有主要的空中植物器官中都存在的保护性表皮屏障，其组成因植物种类而异。作为苹果皮的一部分，表皮蜡和表皮蜡对供人类食用的新鲜水果的皮肤外观和品质特性具有重要作用。通过酶法获得了两个苹果品种“金冠”和“红冠”中角质的具体组成和结构特征，并通过交叉极化魔角旋转核磁共振（CP-MAS13C NMR）进行了研究。全反射红外光谱（ATR-FTIR）和质谱，并通过专门的显微镜技术（原子力显微镜（AFM），共聚焦激光扫描显微镜（CLMS）和扫描电子显微镜（SEM））进行形态表征。根据CP-MAS 13C NMR和ATR-FTIR分析，两个品种的角质均主要由脂肪族组成，并且它们之间显示出很小的差异。通过质谱分析水解角质分析证实了这一点，其中9,10,18-三羟基-十八烷酸; 10,20-二羟基二十烷酸; 10,16-二羟基十六碳烯酸（10,16-DHPA）; 9,10-环氧-12-十八烯酸;分离出的主要单体是9,10-环氧-18-羟基-12-十八烯酸。所获得的角质中多糖和酚类的含量较低，可能与这种生物复合材料的低弹性行为以及苹果角质表面上存在裂纹有关。这些裂纹在金苹果中的平均深度为1.57 µm±0.57，在红苹果中的平均深度为1.77 µm±0.64。这项工作获得的结果可能有助于更好地理解苹果果实表皮的机械性能主要与角质的特定脂肪族成分有关，并有助于更好地研究微裂纹的形成，而微裂纹是赤褐色形成的重要症状。

关键词：角质；表皮;家蝇CPMAS 13 C NMR;原子力显微镜CLMS；扫描电镜

1.介绍

墨西哥的苹果产量在2019年接近67.9万吨，高于2018年的54.7万吨[1]。通常，墨西哥的新鲜苹果产量被其消费量所赶超，墨西哥苹果的出口几乎停滞，奇瓦瓦州是主要出口国，主要出口到美国（627吨）和伯利兹（22吨），在最近两年[2]。

苹果和其他水果一样，例如橘子，柠檬，葡萄柚，草莓等，都被连续的细胞外角质层覆盖[3-5]。这种表皮可以保护苹果免受环境压力

例如风，温度，化学物质和干旱，不仅附着在树上，而且在储存过程中也是如此。先前的研究表明，表皮对这些阻隔性能的贡献最大。没有它，苹果很容易感染霉菌。物理伤害;尤其是水分损失[6,7]。

植物角质层是由角质聚合物制成的基于脂质的复杂生物复合物，并被称为“蜡”的非聚合表皮脂质填充[8]（方案1）。先前的报告显示，家蝇属水果中的蜡成分可能包含烃，醇，醛，脂肪酸，二醇，酯，B-二酮，萜类化合物和酚类化合物。这些表皮蜡的重要性先前已有报道。

方案1.水果表皮的示意图组织。

角质素主要由羟基和环氧羟基C16和C18脂肪酸和甘油组成，但其组成因植物种类，发育阶段[3,9,10]，器官和环境胁迫[11,12]而异。角质成分的这种变化影响角质层的结构和性质。例如，角质成分的变化与植物对病原体多角形[Erysiphe polyi] [13]和灰葡萄孢[Botrytis cinerea] [14]的抗性相关。一些化学物质的共价键合可能涉及特定的含环氧基的角质单体[15]，角质组成也与角质层的机械性能有关[16]。实际上，羟基可以增强角质基质的亲水性，从而具有更高的弹性[17]。最后，角质单体组成决定了羟基含量，从而影响通过聚酯键的交联[18,19]。

不同的研究表明，苹果表皮中早期存在微裂纹

在生长季节，它们会变大，并在季节结束时在表面形成网络[6,20,21]。裂纹的存在使苹果果实容易出现表面紊乱，例如赤褐色或皮肤斑点，从而导致经济损失[22-24]。这些疾病与包括蜡组成在内的不同因素有关[6,24,25]。但是，我们认为，对角质成分的更好了解将为角质层的超微结构和力学性能提供更多的知识。在这项工作中，通过CPMAS 13C NMR，ATR-FTIR和MS获得了来自两个苹果品种的两个角质，分别是“金黄色的美味”和“红色的”。根据这些分析，两种苹果角质素均主要由脂族成分组成，其中主要单体为9,10,18-三羟基十八烷酸； 10,20-二羟基二十烷酸; 10,16-二羟基十六碳烯酸（10,16-DHPA）;9,10-环氧-12-十八烯酸;和9,10-环氧-18-羟基-12-十八烯酸。这些角质中多糖含量低，很容易形成通过CLMS，AFM和SEM观察和分析的微裂纹。

2.结果与讨论

2.1.交叉极化魔术角自旋13 C核磁共振（CPMAS 13C NMR）和衰减全反射傅立叶变换红外光谱（ATR-FTIR）对“金冠”和“红冠”苹果角质的分析

根据报道的酶处理方法分离苹果角质[26]，并通过CPMAS 13CNMR和ATR-FTIR进行分析。对于这两个苹果品种（图1 –金色和图1 –红色），主要的共振分配如下[27]：散装亚甲基（20–40 ppm），是最突出的峰。较小的峰归属于氧化的脂肪族碳（55-85 ppm）；芳烃和烯烃（105-155 ppm）；和羰基（173ppm）。除了这些信号组以外，还可以分配那些属于碳水化合物部分的信号（即使在碳原子数为60时为C6，70-75 ppm时为C2,3,5，83 ppm时为C4，105 ppm时为C1）。比例很小。两个角质中均存在56和64 ppm的峰。这些峰归属于环氧环氧长链脂肪酸（参见补充材料S1-S4）。

图1.来自“金冠”和“红冠”苹果的角质的交叉极化魔角旋转核磁共振（CPMAS 13C NMR）光谱。除了分配的碳水化合物峰外，还检测到环氧化合物，因为它们的信号在δ56和64ppm处。 

ATR-FTIR光谱学已被用于原位表征分离的角质的功能化学基团及其在表皮水平与外源性化学物质的相互作用[28,29]。 ATR FT-IR分析“金色美味”和“红色美味”苹果角质素（分别为图2，金色和红色）显示3365cm-1左右的宽带与多糖级分和残留的羧酸，以及2918和2849cm-1处的强带，归因于CH2的不对称和对称拉伸振动，并伴随着大约1468、1313和725 cm-1处的相应弯曲振动。

2.2.苹果角质碱水解（KOH / MeOH）产品的直接注射电喷雾质谱（DIESI-MS）分析

为了完成对“金冠”和“红冠”苹果角质素的研究，通过分析这种重要生物聚合物中存在的主要单体进行了碱水解。在两种情况下，约95％的表皮材料都被水解。碱性的可溶性产品

通过负离子模式的直接注射电喷雾电离质谱（DIESI-MS）分析水解（见补充材料S5），通过ms / ms分析鉴定的化合物见表1。

图2.来自“金黄色美味”和“红色美味”苹果的角质的衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR）光谱。

[M-H]-精确：精确的分子量，[M-H] -obs：观察到的分子量，％RA：相对面积％。误差[ppm]：所选峰的测量质量与理论质量之间的偏差的绝对值，以[ppm]为单位。

鉴定出的化合物存在于两种角质中，差异很小。在两个角质中鉴定出的主要成分是9,10,18-三羟基十八烷酸； 10,20-二羟基二十烷酸;和10,16-二羟基十六烷酸（10,16-DHPA）。 10,16-DHPA是在不同的角质中鉴定出的最重要的C16链烷酸之一，例如番茄，柑橘角质层和青椒[30]。在“金色美味”（分别为10.2和4.8％）和“红色美味”中，另外两个重要的单体被鉴定为9,10-环氧-12-十八烯酸和9,10-环氧-18-羟基-12-十八烯酸苹果角质（分别为8.26和4.18％）。

这两种环氧化合物，以及9,10,18-三羟基-12-十八碳烯酸和9,10,18-三羟基-十八碳烯酸，也可以在随后的角质中检测到亚油酸的氧化反应后得到。角质素中C16长链酸占主导地位，这很普遍，并且与以前的角质素报道一致[30]。但是，重要的是要强调这些角质苹果中45％的主要单体中的大多数是C18酸。这些C16和C18单体的存在可能是在ATR-FTIR光谱中在1100 cm-1处检测到宽带酯化的原因。质谱分析未在“金冠”和“红冠”苹果角质中检测到芳香族化合物和碳水化合物，这可能是因为它们的含量较低和/或极性较高，这与NMR分析相符。

2.3.苹果角质的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）

CLSM已成功用于植物组织的表皮研究，因为在分析过程中，由于完全没有进行样品的预处理或物理切片，因此细胞保持不变[31]。在这项工作中，CLSM分析了从两个苹果品种“黄金美味”和“红色美味”获得的角质。直接分析没有人工染色或物理切片的样品，由于其自身荧光，可以观察到大多数结构。实际上，在AFM和SEM分析中使用了相同的样品，以更好地比较结构。苹果角质的外表面结构可视化为覆盖有微裂纹网络的光滑表面，这与其他研究的发现一致。这些微裂纹似乎是由四个或更多单元格划定的组，这些单元不一定与肋条相对应（在内表面中观察到）（图3）。

图3.共焦激光扫描显微镜（CLSM）显微照片来自“金黄色的美味”（（A）外表面和（B）内表面）和“红色”（（C）外表面和（D）内表面）苹果的角质。 

从图3可以看出，对两个面的完整分析表明，即使在表面上观察到不同的裂缝，它们似乎也无法完全穿透角质层结构。

2.4. 苹果角质层的原子力显微镜（AFM）

通过AFM分析了苹果角质的地形（图4）。对于“金黄色美味”苹果角质膜，其外表面的粗糙度值为Ra = 533.5±44.5 nm和Rq =689±45.2 nm，内表面的粗糙度值为Ra = 1844±69.2 nm和Rq = 2310±79.1 nm，表明内表面的粗糙度较高；这是因为在内侧表面以角质构型形成的肋。

在“红色美味”苹果角质中，外表面的粗糙度值为Ra= 390±44.5nm和Rq= 486±49.4nm，内表面的粗糙度值为Ra=1237±103nm Rq＝1514±88.3nm。与“黄金美味”角质苹果的尺寸类似，内表面最粗糙。而且，可以从两个苹果的粗糙度测量中观察到

品种认为，“金美味”角质苹果的外表面最粗糙，而与内表面相反，“红色美味”角质苹果的粗糙度更高。

除了粗糙度差异外，内部和外部之间的形貌差异

可以观察到两个品种的面孔（图4）。在外面，像胰岛这样的结构可以观察到裂缝，并且在内表面也可以观察到胰岛。但是，胰岛由类似于壁的加厚肋来界定。在两个角质苹果品种内表面的肋骨上进行的测量表明，“金黄色可口”角质苹果的高度为3.4±0.7 µm，宽度为10.7±2.9μm，对于“红色可口”而言角质苹果，排骨的高度是7.8 ±2.7 µm，宽度为16.4±5.1 µm。通过这些测量，在“红色美味”角质苹果中，肋骨的高度和宽度更大。这些观察结果与CLMS和SEM分析得出的结果一致。

通过CLMS和AFM获得的图像显示了两个苹果角质膜外表面的“小岛”或微裂纹中描绘的一组细胞的特定形成。这些果实的生长和成熟过程中会形成这种裂纹[7]。在此过程中，表皮中可能产生拉应力，导致出现裂纹。对于“红色美味”角质苹果，

裂纹更清晰，平均深度为1.6±0.6 µm。对于“金黄色的美味”角质苹果，裂纹的平均深度为1.8±0.6µm，并且定义较浅，因为它们的宽度较宽

以及在“红色美味”角质苹果中发现的那些。

图4. AFM获得的地形图。图（a–c）来自“金”苹果： 

(a) 外表面的2D图像以及内表面的（b，c）2D和3D图像；图（d–f）是从“红”苹果中获得的：（d）外面的2D图像和（e，f）里面的2D和3D图像。

2.5. 苹果角质的扫描电子显微镜（SEM）分析

将用于CLSM分析的相同样品溅射涂覆并安装用于SEM分析。在不同的工作条件下，改变加速电压，工作距离和放大倍数，可以捕获图像。使用二次电子模式进一步记录图像。

图5A，5E示出苹果角质层表面覆盖有以微裂纹图案为特征的无定形蜡层，该微裂纹图案的长度，深度和分布图案不仅在栽培品种之间，而且在相同水果的各部分之间也具有相当大的变化。根据图5B，F，无定形蜡层的缩放，裂纹在“红色美味”苹果角质中更深且具有更长的长度。但是，它们没有延伸到与CLMS分析一致的内表面。实际上，根据图5C，G，内表面没有微裂纹的迹象。除了内表面的肋骨网络外，还发现了鳞片状的表皮蜡状晶体（扁平的，通常是多边形的）。

晶体，具有明显的边缘，以不同的角度附着在表面上，通常像瓷砖一样重叠）和薄片（没有明显边缘，规则或不规则边缘的扁平晶体，垂直附着在表面上）（图5C，G）。这些板和血小板不规则地分散在无定形蜡层的内表面上，并经常密集地集中在微裂纹的开口内（图5D，H）。在苹果品种和角质苹果切片中，它们的宽度（1.1-5.6µm），高度（0.7-3.2 µm），厚度（0.1-0.4 µm）和密度不同。

图5.“金色美味”（（A，B）外表面和（C，D）内表面）和“红色”（（E，F）外表面和（G，H）内表面）的角质的SEM显微照片苹果。 Cr：表皮微裂纹。 fl：表皮蜡片。 

据报道，在使用SEM分析的苹果角质中存在片状[7,25]。即使大多数作者都认为这些薄片是表皮蜡状晶体，他们中的一些人仍认为它们是由SEM技术产生的伪影，无法用CLMS或其他显微镜仪器观察到[31]。根据我们以前的研究[32,33]，源自番茄和水果角质的单体和低聚物可以形成良好的组织，形成均匀的膜，因此这些薄片的存在可能对应于聚合过程中脂族化合物的血小板。

除了这种水果整个生长过程中的生化变化外，这还会影响皮肤。

对于苹果而言，角质的机械性能可能与影响表皮粘弹性行为的化学组成有关。番茄（S. lycopersicum）表皮的研究表明，表皮成分的定量变化会影响表皮的弹性/粘弹性行为[34,35]。特别是，与角质网刚性有关的多糖和一些酚类化合物（如类黄酮）起着生化调节剂的作用[35]。与其他水果的角质素有关的多糖和酚类化合物含量较低，可能会影响这些苹果角质素的弹性，当果实在发育和成熟期间膨胀时，会引发聚酯的断裂。

为了阐明多糖在角质的机械行为中的作用以及如何影响其粘弹性，需要进行更多的研究。

3.材料和方法

3.1.化学制品

三氟乙酸和组织培养水购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。黑曲霉果胶酶（EC 3.2.1.15），黑曲霉纤维素酶（EC 3.2.1.4）和黑曲霉半纤维素酶（EC 3.2.1.4）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。其他实验室化学品均为试剂级或更高。

3.2.酶法分离“金冠”和“红冠”苹果角质

通过公开的三步方案从两个苹果品种的皮肤中分离出角质[26]：

（i）通过果胶酶处理去皮并随后分离角质层； （ii）用连续的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶处理酶消化细胞壁多糖； （iii）通过依次用甲醇，二氯甲烷和四氢呋喃进行索氏提取进行彻底脱蜡。

3.3.苹果角质碱水解

向30mg的角质中加入0.4mL的去离子水和2.0mL的1.5N甲醇KOH。该混_合物装有回流冷凝器，并在70–75℃下搅拌8或22 h。使用标准程序，用CHCl3-MeOH提取角质素单体[26]。称重干燥的萃取液，溶解在1.0 mL的CHCl3-MeOH（17：3）中，并通过玻璃棉过滤到自动进样瓶中。基于未水解的物质，计算反应产率。碱水解8小时的典型收率为90–95％。

3.4.固态NMR光谱分析

使用在配备有固态NMR的Varian Instruments Unityplus 300宽孔光谱仪（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托）上进行的标准CPMAS13C NMR实验分析不溶性聚合物。共振频率为74.443 MHz，通常的采集时间为30 ms，两次连续采集之间的延迟时间为2s，交叉极化（CP）接触时间为1.5 ms。通常，将每个30mg样品装入5 mm转子和Doty Scientific（哥伦比亚，SC，美国）的超音速幻角旋转（MAS）探针中，然后在6.00（0.1 kHz和室温）下旋转约10 h。在主要的羰基或脂族碳峰的上场或下场均未观察到旋转边带。用50 Hz的指数线展宽处理所得数据。

3.5.ATR-FTIR光谱分析

ATR-FTIR光谱是通过配备了砷化铟镓（InGaAs）检测器的FTIR模块IR2（法国龙朱梅的Horiba Jobin Yvon）和与法国Longjumeau的Horiba Jobin Yvon LabRam HR800光谱仪连接的FTIR模块IR2记录的。使用ATR接触物镜，在4000–400 cm-1范围内记录光谱，光谱分辨率为4 cm-1，每次测量32次扫描。

3.6.原子力显微镜分析

使用BioScopeCatalyst模型显微镜（布鲁克，圣巴巴拉，美国，美国）以MESP探针（布鲁克，Camarillo，美国，美国）轻拍模式在空中获取图像。最初，手动选择了六个表皮，每个面约8×8 mm2，三个，每个样本获得一张图像80×80 µm2。使用Nanoscope Analysis软件（版本1.8，Bruker，Santa Barbara，CA，美国）对图像进行分析，从而确定粗糙度Ra（表面粗糙度的算术平均值）和Rq（表面粗糙度的均方根）。此外，对位于两个品种内表面的肋骨的高度和宽度进行了测量。

3.7.共聚焦激光扫描显微镜分析

对于CLSM分析，将每个样品固定在玻璃片上，并在CLSM（LSM 710 NLO，Carl Zeiss，耶拿，德国）下用物镜EC Plan-Neofluar 10×/ 0.3观察。激光波长激发同时为405、488、561和633 nm。使用的这种捕获模式是一种光谱成像技术，可自动输出多个标记样品的分离通道。该工具检测香蕉皮的自发荧光信号，并与420至720 nm之间的顾客（纤维素）进行实验比较。 Z-stack图像（3D图像）通过ZEN 2010软件（卡尔·蔡司，耶拿，德国）以512×512像素的RGB颜色捕获，并以8位TFF格式存储。

3.8.直接进样电喷雾质谱（DIESI-MS）分析

使用在负离子模式下运行的电喷雾电离（ESI）接口（BrukerDaltonics，Billerica，MA，美国）在Bruker MicrOTOF-QII系统上进行DIESI-MS分析。将重悬于1 mL甲醇中的10 µL样品溶液用0.25 µm聚四氟乙烯（PTFE）过滤器过滤，并用甲醇1：100稀释。将稀释后的样品直接注入ESI离子源并以阴性模式进行分析。氮气以4L/min（0.4Bar）的流速用作干燥和雾化气体，气体温度为180℃，毛细管电压设置为-4500V。光谱仪通过ESI-TOF校准调校混合校准液（墨西哥墨西哥埃斯托多的Toluca Sigma-Aldrich）。使用正电和负电喷雾电离（ESI +/-）进行MS / MS分析，

然后通过Bruker Compass DataAnalysis 4.0（BrukerDaltonics，技术说明008，2004，Billerica，MA，USA）分析获得的片段。建立5 ppm的准确度阈值以确认元素组成。

3.9.扫描电子显微镜分析

使用导电双面胶带（Plannet Plano）将苹果果实的分离的表皮膜固定在铝制支架上，使用SPI溅射镀膜机在25 mA下用碳（60:40）涂膜1分钟，并在场发射扫描中进行检查电子显微镜（JEOL JSM-7800F，Tokio，Japan）在1.5 kV下使用。针对扫描电子显微镜中的加速电压，对沉积碳涂层厚度约为10 nm的溅射条件进行了优化。

4.结论

从“金黄色的美味”和“红色的”苹果中获得了角质。根据CPMAS 13C NMR和ATR-FTIR，两种苹果角质素均主要显示脂族结构域。通过这些分析，检测到非常小的多糖区域，而没有酚类化合物的存在。主要单体，特征为9,10,18-三羟基十八烷酸； 10,20-二羟基二十烷酸; 10,16-二羟基十六烷酸（10,16-DHPA）;9,10-环氧-12-十八烯酸;通过DIESI-MS在两个苹果角质中鉴定出了9,10-环氧-18-羟基-12-十八烯酸和9,10-环氧-18-羟基-12-十八碳烯酸，没有单糖或酚类化合物，这与固态NMR和ATR-FTIR一致。角质中多糖和酚类化合物的含量低可能使其在生长和成熟过程中易于形成微裂纹。但是，需要更多的研究来了解这一水平的理化特性，并将其与某些生理病如赤褐色形成联系起来，这会导致经济损失。

补充材料：以下内容可在线获得，S1：“金美味”苹果角质的CPMAS 13C NMR光谱，S2：分析“金美味”苹果角质的CPMAS 13C NMR光谱中的“低强度信号” ：“红色美味”苹果角质的CPMAS 13CNMR光谱，S4：“红色美味”苹果角质的CPMAS 13C NMR光谱的分析，S5：DIESI（-）光谱的比较分析水解后的“黄金美味”（上部光谱）和“红色美味”（下部光谱）苹果角质。

作者贡献：M.B.G.-P.和D.A.-B.构思并设计了本文的主要思想，进行了NMR和DIESI-MS实验，分析了实验结果，并撰写了论文。司法部和J.V.M.-M.进行了CLMS和AFM实验，并帮助讨论了结果。 H.F.M.L.进行了SEM实验并帮助讨论了结果。作者阅读并批准了最终手稿。调查，D.A.-B.，M.d.J.P.F.，J.V.M.-M.，H.F.M.L。和M.B.G.-P.；项目管理，D.A.-B。和M.B.G.-P .；监督，D.A.-B。和M.B.G.-P.所有作者均已阅读并同意该手稿的发行版本。

资金：这项研究由国家科学技术委员会（CONACyT）资助，以资助项目253570和SIP-IPN资助20201066和20201968。

利益冲突：作者声明没有利益冲突。资助者在研究的设计中没有作用。在数据的收集，分析或解释中；在手稿的写作中；或决定发布结果。

参考文献（展示部分文献内容，查看全部看到原网站查看）

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