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患者核细胞揭示环状线性RNA高活性疾病生物标志物(结论

患者核细胞揭示环状线性RNA高活性疾病生物标志物(结论

具有脂质特异性寡克隆IgM谱带特征的患者外周血单个核细胞的全转录组分析揭示了两个环状RNA和两个线性RNA作为高活性疾病的生物标志物


患者核细胞揭示环状线性RNA高活性疾病生物标志物(上)



3.3. 线性成绩单表达谱


在本研究中,我们还通过RNA序列分析了线性转录组,鉴定出115,869个转录本,总读取次数≥10。我们使用检测标准应用了一个额外的过滤器,该过滤器可以识别出具有一致表达模式的84,863个线性RNA,从两组中均检测到92.8%。其中,有2441个转录物被差异表达(p<0.05和FC> | 2 |),两组均检测到1421个转录物(图3B)。其余的转录本是特定于一组的,仅在LS-OCMBs阴性患者的PBMC中表达382份,而在LS-OCMBs阳性的患者中表达638份。

我们选择了十个候选线性RNA来通过RT-qPCR确认它们的差异表达。

更大的队列。如图3D所示,在LS-OCMB阳性患者的PBMC中证实了IRF5和MTRNR2L8的较低表达(两个转录本中FC = -1.33; p <0.05)。差异表达的线性RNA主要在免疫系统的生物过程中富集。图4显示了最有意义和最丰富的术语(FDR<0.01和倍富集> 2)。补体激活,体液免疫应答和I型干扰素信号传导

路径出现在最丰富的术语中。


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4. 2441 DEmRNA的基因超表达测试结果。显示了最显着的(倍富集> 2)和富集的(FDR <0.01)GO生物过程。条形根据其FDR值进行着色。 DE-差异表达。 FDR-错误发现率。


3.4. circRNA和线性RNA作为高度活跃疾病的生物标志物的评估


为了评估四个经过验证的RNA作为LS-OCMB状态血液生物标志物的潜力,我们进行了ROC曲线分析。如表2所示,测试了不同的RNA组合以找到区分两组的最佳性能。我们发现,circRNA和线性RNA的不同组合可改善性能,达到约70%的AUC值。

表2.四个候选成绩单和不同组合的ROC分析结果。ROC-接收机的工作特性。

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4. 讨论区


在这项工作中,我们表征了具有明显LS-OCMB状态的MS患者的PBMC的整个转录组。该分析和验证实验表明,LS-OCMB阳性患者的PBMC的整体转录组与LS-OCMB阴性患者的PBMC的整体转录组不同。

RNA-seq结果显示,两组之间有124个circRNA和2441个线性RNA差异表达。有趣的是,仅在一组中检测到58%的线性RNA,突显了来自具有不同LS-OCMB状态的患者的PBMC中存在特定的表达模式。是真的;但是,我们的RNA-seq样本数量有限,应谨慎对待这些观察结果。

据我们所知,以前没有circRNA与MS相关。 Circ_0000478位于13号染色体,其宿主基因为von Willebrand因子A结构域,包含8个(VWA8)。有趣的是,该基因的线性转录本也是我们数据集中差异表达的线性RNA之一,其折叠变化为-3.23(p = 0.047)。最近已经描述了该转录本,并编码功能仍不确定的线粒体蛋白[32]。关于circ_0116639,它位于22号染色体上,与EP300基因重叠。 EP300是一种组蛋白乙酰转移酶,在我们的研究中被检测到但没有差异表达。 circRNA及其宿主基因表达模式的这些差异揭示了circRNA的生物发生与其宿主基因的生物发生是独立调控的,如先前所述[33]。

值得注意的是,干扰素调节因子5(IRF5)是已确认的下调转录物之一,该基因的多态性与国际多发性硬化症遗传学联盟进行的最后一次全基因组关联分析中存在发展MS的风险有关。以及西班牙人群的复制研究[34,35]。此外,该基因中的SNP与CSF中CXCL13的水平增加有关,CSF是与高度活跃的疾病相关的趋化因子[36]。最重要的是,动物模型显示IRF5与小胶质细胞极化有关对中风和阿尔茨海默氏病有炎性反应(M1)[37,38]。正如其他作者在外显子组测序项目中所暗示的那样,这可能暗示了小胶质细胞在更积极的疾病过程中的意义[39]。尽管如此,我们的发现是在外周PBMC中进行的,因此IRF5来源可能是外周单核细胞或巨噬细胞。无论如何,需要进一步的研究来揭示IRF5在高度活跃的MS疾病病程中的意义。

另一方面,MT-RNR2像8转录本(MTRNR2L8)是另一种经过验证的线性转录本,在LS-OCMB+组中表达较低,编码在11号染色体上,有趣的是,它跨越了miR-4485茎的位置环定位,是本研究中选择用于验证的四个miRNA之一。根据微阵列数据,miR-4485在MTRNR2L8中被下调在LS-OCMB +组中。 MTRNR2L8是mir-4485的宿主基因这一事实可能解释了,即使无法验证miRNA,这组患者的两个转录本也都被下调了。这些结果表明这两个RNA之间可能存在相互作用,可能与更活跃的疾病有关,但是需要进一步的研究来证实这一假设。根据UniProt的研究,MTRNR2L8具有神经保护和抗凋亡因子的作用,并且发现重度抑郁症患者在特定区域的大脑中MTRNR2L8的含量增加[40]。尽管该基因的功能尚不清楚,但对于MS而言,作为神经保护因子的可能作用非常有趣,因为我们发现该基因在PBMC中被下调。但是同样,应该进行进一步的研究以揭示外周血中MTRNR2L8表达与疾病活动以及这种关系的潜在机制之间的可能联系。

基因过度表达测试表明,与补体激活,体液免疫反应和I型干扰素反应有关的生物学过程是最丰富的术语。值得注意的是,IgM抗体的鞘内合成以前与鞘内补体激活相关[41],并且已经清楚地证明了其在脱髓鞘和轴突损伤中的作用[42]。有趣的是,补体系统的不同组成部分已与MS相关,某些组成部分的血浆水平已被提议作为MS疾病状态生物标志物[43]。值得注意的是,这些过程在具有高活性疾病标志物的患者的PBMC中的改变基因中富集。该分析可能表明这些患者的免疫反应可能改变,这可能解释了其较高的疾病活动性,但仍需要进一步和其他类型的研究来探索这一假设。

这项研究的主要目的是鉴定血液中的一种或多种可以区分阳性和阴性LS-OCMB患者的生物标志物,从而可以用作高度活跃疾病的更容易获得的标志物。 ROC曲线分析显示,这些标记组合在一起具有大约70%的准确度,通常被认为是可以接受的性能[44]。考虑到这些都是在血液中测量的,它们可能有助于诊所进行重复测量,而连续采集CSF样品则存在严重缺陷。鉴于他们的有效治疗范围可能比较良性或较不活跃的疾病形式要窄,因此正在努力确定患有高度活跃疾病的患者[45]。与此相一致,已经提出了几种生物标记物来鉴定具有侵略性疾病进程的个体,例如神经丝轻链的CSF水平,CXCL13或CHI3L1 [46-48]。其他作者还报告了具有不同疾病活动的患者之间非编码转录组的差异。 Quintana及其同事研究了一组具有LS-OCMB特征的MS患者和其他神经系统疾病(OND)患者的miRNA在CSF中的表达[49]。他们发现OND组和LS-OCMB +组之间miR-30a-5p,miR-150,miR-645和miR-191的表达存在差异,但他们发现LS-OCB阳性和阴性患者之间没有任何差异OCMB。由于他们的研究与本研究之间的分析平台不同,我们无法检查来自Quintana及其同事的数据中候选miRNA的表达。另一项研究报道,miR-24-3p的血清水平与疾病进展指数相关,通过计算EDSS值除以疾病持续时间得出,但未测量LS-OCMB的状态[50]。最近,长非编码RNA在血液中的表达也被描述为显示根据年龄相关的MS严重程度评分,区分高活跃MS患者与其他病程较轻的患者的能力[51]。

所有这些研究都突出了能够识别高活动性疾病患者的生物标志物的需求,以及科学界朝着这个方向所做的努力。此外,鉴于每项研究使用不同的参数来对各组患者进行测量和分类,因此对于什么是侵略性疾病过程的定义达成共识也很重要,这使得它们之间的比较确实具有挑战性[52 ,53]。该组患者的早期识别可以受益于不同的治疗建议,并且;因此,有可能改善疾病的长期结果。

我们的miRNA分析研究发现了两组之间差异表达的miRNA,尽管尚未通过RT-qPCR实验验证。在这方面,其他技术(例如液滴数字PCR(ddPCR))可能有助于减少变异性并发现组之间的细微差异。尽管据报道在基因表达研究中使用ddPCR并不会增加灵敏度,并且只要起始物质的量足够多且反应中没有污染物,其性能是相似的[54,55]。尽管如此,在未来的验证项目中可以考虑使用该技术,该项目旨在明确丢弃或将那些miRNA用作生物标志物,以用于更具侵略性的MS疗程。



5. 结论


总之,我们已经鉴定出在LS-OCMB阳性患者中被下调的两个circRNA和两个线性RNA。我们的发现对于多发性硬化症的生物标志物领域非常重要,因为它们可以有助于识别高度活跃的疾病患者。此外,与其他生物标志物相比,一个重要的优势是可以在血液中检测到它们,从而可以进行连续检测来监测其水平,而腰椎穿刺不建议这样做。为了确定其效用,还需要在更大的人群中进行进一步的研究,但是我们认为,它们可以作为确定哪些患者应进行腰穿以确认其LS-OCMB状态的首选筛查工具。

 

补充材料补充材料可以在http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/540/s1上找到。表S1:样品和实验的完整列表,其中包括每个样品。表S2:RT-qPCR实验中使用的测定和引物。图S1:PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图像和Sanger测序结果显示circRNA的反向剪接。

作者贡献:概念化,D.O。 (DavidOtaegui)和M.M.-C .;方法论(DavidOtaegui),M.M.-C.,L.I.,TB.D.O。(Danel Olaverri)和L.M.V .;验证和L.S .;形式分析,L.I.,D.O.

(DanelOlaverri),TB,M.M.-C.,M.E。和L.C.-F .;调查,L.I.,M.M.-C.,M.E.,L.C.-F .;资源,A.P.,T.C.-T.,M.E.,L.C.F.,L.M.V。和D.O. (David Otaegui);写作-原始草稿,L.I.,D.O。 (David Otaegui)和M.M.-C .;写作-审查和编辑(Danel Olaverri),TB。,Á.P.,TC.C.T.,L.M.V .;可视化,L.I.,D.O. (Danel Olaverri),M.M.-C .;监督,D.O.(DavidOtaegui),美国密西西比州立大学和L.M.V .;项目管理,

做。 (David Otaegui)和M.M.-C .;资金收购,L.M.V.,D.O. (David Otaegui)和M.M.C.所有作者均已阅读并同意该手稿的发行版本。

资金:这项研究由萨洛德·卡洛斯三世研究所(PI17 / 00189和PI15 /00513),西班牙红色硬化菌(REEM)(RD16/0015/0007和RD16/ 0015/0001),吉普斯夸省理事会(109)资助/ 18)和巴斯克政府(PRE_2019_2_0206)和ELKARTEK计划

致谢:作者要感谢Biodonostia Health Research Institute基因组平台的工作人员。

利益冲突:作者声明没有利益冲突。资助者在研究的设计中没有作用。在数据的收集,分析或解释中;在手稿的撰写中,或在决定发表结果时。

 

参考文献(展示部分文献内容,查看全部可在原网站)

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