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研究

大火前后的巴黎圣母院大教堂的声学调查
布莱恩·F·G。卡茨*和安东尼·韦伯法国巴黎CNRS Sorbonne大学Jean Le Rond d´Alembert研究所UMR7190，法国； antoine.weber@dalembert.upmc.fr*通讯：brian.katz@sorbonne-universite.fr 收到：2020年9月27日;接受：2020年10月29日;发布时间：2020年11月6日摘要：巴黎圣母院大教堂是世界上最著名的礼拜场所之一。它的体积大，加上相对裸露的石头结构和大理石地板，导致相当长的混响时间。大教堂在2019年遭受大火，主要损坏了屋顶和拱形天花板。尽管此空间臭名昭著，但有关该空间的声学参数的已发布数据很少，这些数据并不一致。恢复了1987年的存档测量记录，发现其中包括几次气球爆炸。 2015年，针对虚拟现实项目进行了测量会议。这两个阶段的结果之间的比较显示，在开火前，混响时间略有减少（8％）。火灾发生1年后，最近在施工现场进行了测量。与2015年的数据相比，混响时间显着减少（20％）。本文介绍了这些测量的初步结果，并提供了有关这具历史悠久的朝拜空间在2019年大火之前和之后的声学记录。 关键词：室内声学测量巴黎圣母院；混响时间文化遗产1. 介绍礼拜场所的声学已成为数十年来研究的主题。由于其巨大的规模，这些空间已在多个世纪以来用于文化和宗教活动。这样的空间经常表现出声音异常（例如，耳语的画廊和耦合的体积）。吉隆（Girón）等人综述了这项研究的重要部分。 [1]，讨论了不同的实验程序，结果及其理论解释。在具有重要历史意义的空间中进行了许多著名的研究：圣彼得大教堂[2]，圣索非亚大教堂（Haghia Sofia）和苏莱曼清真寺（SüleymaniyeMosque）[3]，圣约翰洗礼池[4]，圣日耳曼德佩雷斯修道院[5]和圣保罗大教堂[6]。巴黎圣母院大教堂（CathédraleNotre-Dame de Paris）是世界上最著名的礼拜场所之一。这座中世纪大教堂被广泛认为是法国哥特式建筑的最好典范之一。大音量加上其巨大的裸露石灰石和大理石表面，导致长的混响时间。尽管该空间声名狼藉，但很少有已发布的有关该空间的声学参数的数据示例。巴黎哥特式大教堂建于12世纪末，成为欧洲音乐创作的象征地，历史学家称其为“巴黎圣母院”。文件证明了这一时期的音乐活动，并且可以认为这种巴黎复音的惊人发展与1182年新合唱团举行的礼拜式组织相吻合。巴黎圣母院大教堂的法令颁布于1198年和1199年，主教Eudes de Sully证明了大众，办公室和贝纳迪卡莫斯·维斯珀多米诺骨牌的两种，三种和四种声音的实践[7,8]。 我们很幸运有一位英国校长撰写的历史性文字[9]，描述了这座大教堂合唱团1275年左右的音乐习惯，在此之前，器官和半即兴的传导性的声音可能会朝后殿升起在各种手稿中都有记载，这些手稿证明了Magnus liber organi的丰富性[10]（巴黎圣母院在12世纪和13世纪之交时使用的拉丁语“器官大典”）。几个世纪以来，这种方法不断发展，随着格里高利旋律的出现，这些旋律逃离了封闭的合唱团，或者随着游行队伍而流通，风琴，铃铛的声音和法佛对位的复调作品混合在一起。 “ 1498年任命安托万·布鲁梅尔（Antoine Brumel）带来了新鲜的空气：费拉拉公爵未来的合唱团指挥官带来了佛朗哥-佛兰德和弦的最好和最新的复音” [11]。音乐史将铭记安德烈·坎普拉（AndréCampra），让·弗朗索瓦·拉洛埃特（Jean-FrançoisLalouette）或让·弗朗索瓦·莱苏厄尔（Jean-FrançoisLesueur）等伟大的大师和作曲家的名字，他们在革命时期后组成了著名的加冕典礼，供拿破仑进入大教堂1804年，以及加冕大礼的各种作品。2019年4月15日，巴黎圣母院大教堂的阁楼发生火灾。由此产生的损坏摧毁了屋顶，并在尖顶和其他碎屑掉落时在拱形天花板上留下了三个大孔。随着修复工作的继续，在大教堂的结构和材料方面进行了大量的记录工作，这项工作介绍了近期的工作，以记录大教堂的室内声学状况，对火灾前和火灾期间采集的数据进行了分析。重建过程。这项工作的某些要素先前已经在科学会议上提出过[12]。2. 已发布的声学数据尽管该空间声名狼藉，但很少有已发布的有关该空间的声学参数的数据示例。 Hamayon [13]提出了混响时间估计作为八度频段的函数[125至4000 Hz：8.5、8.0、7.5、6.0、4.5、2.7 s]。 Mercier [14]提出的建议略有不同混响时间值[125至4000 Hz：8.5、8.2、6.5、6.2、4.7、2.5 s]。两项研究都仅介绍了混响时间，而没有任何参考或测量协议信息。3. 材料和方法：20世纪和21世纪的测量 3.1. 1987年的历史数据档案记录（1987年）是从有关一个新器官的声学研究中恢复的[15]，其中包括几个气球破裂。测量协议—图1a显示了1987年带源-接收器（SR）位置的测量的测量计划。尽管采用了使用不同刺激的多种技术，但由于缺少刺激细节（例如，消声信号，扫描刺激参数），仅可利用气球爆裂源。从源位置1记录了三个气球爆炸，从源位置2记录了1个气球爆炸。这些位置对应于大教堂的“相对”源位置[16]，其中S2在变位子和祭坛区域的中心附近。 S1在讲坛附近，更靠近公共区域的中心。测量设备的输入-用13个全向麦克风记录声音，这些麦克风连接到多轨线对线录音机（Tascam）。虽然不是理想的全向声源，但气球爆裂在某些情况下还是有用的工具，它提供了便携式脉冲源[17]。记录从模拟磁带上数字化。图1.巴黎圣母院大教堂（a）1987，（b）2015和（c）2020届会议的测量计划。位置居中于编号源（S＃（红色））和麦克风（＃（蓝色和绿色））标签下，或在所测量的网格过于密集的点处。 2020年计划（c）还在阴影区域指示了无法放置测量设备的脚手架（黄色），人为禁止区域（红色）和禁止区域的受阻碍/损坏的地面（蓝色）。3.2. 2015年的详细测量在2019年大火发生前的将近4年的2015年4月13日晚上，在一次小型音乐会演出之后进行了一系列声学测量。测量协议-图1b显示了测量计划，突出显示了2015年测量的S-R位置（请参见图2a中的照片）。源位置反映了1987年的测量结果，以及代表合唱团的S3和1987年测试的S4，尽管在进行测量后没有发现气球爆裂。在2个正弦扫描的三个测量组中，执行了麦克风1–8更改位置的操作（高度为1.5 m，这些麦克风的更改位置由测量位置后面的字母表示）。由于外部噪声过大，首次测量重复进行了两次，共87次，形成了4组测量值。麦克风9-16悬吊在天花板上（88层上方7 m，以捕获混响场供唱片工程师用于音乐会录音），因此89保持在同一位置，因此记录了八个类似的RIR。这些重复的90次测量允许研究随时间变化的声学响应的稳定性，其中91次解决了温度变化的细微影响[18]。在最后一次扫描测量之后，在每个源位置记录一个气球爆炸，而接收器在最终位置。（a）（b）图2.（a）2015年的状况照片，突出显示了测量期间测量设备，地毯滑道和小型音乐会立管； （b）2020年，突出显示在测量过程中由遥控机器人，障碍物和中殿的总体空状态拉动的麦克风三脚架。测量设备的输出-音频输出被发送到放大器（SAMSOM，美国Servs120a型，希克斯维尔），并依次发送到四个微型十二面体声源（三博士，3D-032型，日本东京）。信号-激励信号基于扫频正弦法。扫描频率从20到20,000 Hz，在20 s内呈指数增长。但是，由于这些特定扬声器的频率响应，在250 Hz八度频段以下的能量不足，无法进行分析。使用DAW软件Reaper和声卡（RME，Fireface 800，德国海姆豪森，德国）以44.1 kHz的采样率播放扫描。测量设备的输入-混响信号是由两个测量链记录的，因为测量的会话是与音乐会录音设备一起进行的。（I）用5个全向麦克风（4个DPA（丹麦Alleroed），4006型（1-4）和1个Schoeps（德国卡尔斯鲁厄）MK5型全向麦克风（5）以44.1 kHz的采样率记录扫描。 ，1个虚拟头（KU-80，配备DPA 4060）和1阶Ambisonic麦克风（Core Audio，Tetramic，Teaneeck，NJ，美国），所有这些都使用声卡（RME，Fireface 800）录制。 ）使用其他11个全向麦克风（6个DPA 4006型（11–16），5个Schoeps MK5型全向麦克风（6–10））和声卡（RME）以48kHz的采样率记录扫描，Micstacy）。3.3. 2020年重建后大火的测量准许进入重建现场，并于2020年6月30日进行了声学测量。由于工作现场的限制，只能进入某些区域。由于存在掉落碎片的风险，中殿和中庭已禁止人员进入，如图1c所示。链节/坛大理石地板的中央部分被尖顶掉落损坏。合唱团区域杂乱无章，由救援队整理，因此完全无法进入。许多侧面祭坛已被用来存储物体。还安装了用于移除器官的脚手架和围绕中殿的保护屏障（建筑围栏和腰高的穿孔金属板）。见图2b中的照片；在线（https://youtu.be/YLi7ASosKvw）上有一段简短的视频记录了测量会话。测量协议-图1c显示了测量计划，突出显示了2020年测量的S-R位置。在给定访问限制的情况下，选择扬声器的源位置S1，使其尽可能接近先前测量中使用的位置。源位置S2用于手持式脉冲源，因为这是最接近S1的位置。遥控机器人（用于隧道检查）被用来拉动安装在三脚架上的麦克风。麦克风位置1-5代表第一测量轨迹。由于剩余的时间，机器人的返回轨迹（位置6-19）允许更密集的分布。从位置S1开始进行抽奖。测量设备的输出-声源是电池供电的十二面体声源（Look Line，S103 ACDC，意大利Massa Finalese），配备有自己的内部放大器和扫频发生器，远程控制，位于声源位置S1。激励信号是内部20 s扫描正弦波。在禁区的极限处，从源位置S2进行了几次补充冲动刺激，手枪开枪射击和气球爆裂。测量设备的输入-混响的信号记录在各种便携式记录设备上，以限制由于机器人操作而引起的布线和混乱。除了使用一对MS（Zoom，H6）外，还使用两个与便携式录音机（Zoom，H6，东京，日本）连接的全向麦克风（Bedrock，BAMT1 1/2”，荷兰代尔夫特）进行录音。将两个3D麦克风（Core Audio，Tetramic和Octomic）记录到便携式录音机（Zoom，F8）上。最后，使用了两个自主3D麦克风（Zoom，H3-VR），一个与360°摄像头（三星，Gear360，韩国首尔）配合使用。源/接收器的高度为1.7 m，受限于用于放置设备的带轮三角架设备。3.4. 后期处理随后的反卷积扫描正弦刺激，采样率转换和后处理步骤在MATLAB中执行。根据我们的内部MATLAB IR分析（IRA）工具包，根据ISO 3382标准对RIR进行了分析[19]。3.5. 建筑细节巴黎圣母院长约130 m，宽48 m，高35 m。在与巴黎圣母院办公室的电话交谈中，确认在几个区域安装了地毯滑道，并且在与前两个海湾相邻的两个礼拜堂（侧面壁or或海湾）中增加了两个确认亭。在这段时间里因此，1987年和2015年之间的区别主要是安装了地毯滑轨（见图2a和3a）。从2015年到2020年，大火后的主要区别是拆除地毯滑道，拆除长椅和拱形天花板上的孔。图3b显示了修复团队在天花板上报告的主要孔洞。使用2D投影（忽略高程拓扑），建筑图纸中的孔大小估计为263 m2。根据上述尺寸，这相当于包围盒表面积的1％。（a）(b)图3.巴黎圣母院大教堂的示意图突出了特定的表面。 （a）突出显示座位位置（黄色）和增加的地毯流道（红色）的计算机模型； （b）指出拱形天花板（2020）中主要孔洞（红色）的建筑图。4. 测量结果 4.1. 声学参数由于三个测量会话期间信源/接收器位置的变化以及2020年测量条件的巨大差异，此处介绍的初步分析重点是混响时间测量，而不是对本地建筑特征更敏感的参数。在所有三种测量条件下，通过全向麦克风计算平均混响时间（T20），如图4a所示。图4.接收机平均混响时间汇总，衰减曲线示例和耦合体积分析，（a）具有标准误差棒的全向麦克风的平均混响时间（T20）。 2020年的结果显示了扫掠刺激（S1）和脉冲源枪击（S2，Rec位置1-5）的结果； （b）八度带滤波的RIC衰减，标准化，优化的SNR截断，2020扫描激励数据集的示例； （c）全斜率衰减500Hz-八度频带分析分布，显示RIC衰减曲线中所识别弯曲点的早期和晚期混响时间以及相对时间（BPt）和电平（BPdB）（[20]，以获得参数详细信息）。带刻度的箱线图显示了数据分布的中位数，95％置信区间，第25和第75个百分位数。 2020年测量协议采用了非同步音频输入/输出设备。虽然设备之间精确时钟速率的差异可能会导致解卷积信号的时间失真，但Hak和Hak [21]已表明，与MLS信号相比，这种误差对扫频刺激的影响较小。另外，在该研究中发现典型的时钟误差足够小，以致混响时间的预期偏差将小于百分之几。为了验证异步措施，还从源位置S2计算了2020年脉冲源枪射击的混响时间。结果表明，两种测量方法之间的差异在不同位置和频率的标准误差范围内有所不同，除了250Hz频段显示稍高的值（增加7％）和125 Hz频段缺乏足够的分析能量。从整个测量时段的混响时间来看，从1987年到2015年平均降低了8％。2015年和2020年之间的比较显示，整个频段的降低显着得多，T20的平均降低了20％。仔细检查RIR可以提供其他信息。图4b中显示了用于计算上述房间声学参数的RIC示例。衰减曲线显示出一个陡峭的阶跃或“悬崖”响应，正如在露天剧院中所观察到的[22]。考虑到除了光滑的空地板以外没有近端反射表面，这是合理的。在响应的较早和较晚部分之间，衰减率会出现一些细微变化，这表明体积行为呈轻微耦合。使用行进线多斜率分析方法对此进行了进一步分析[23,24]。为简便起见，此分析仅限于500 Hz倍频程滤波的RIR，并使用可比较的源和接收器位置与2020年缩小的测量区域将2020年的测量结果与2015年的子集进行比较。此方法除了可以描述时间和水平上的弯曲点外，还可以估算RIC的早期和晚期衰减率。相对于RIR发作。由于耦合体积衰减的行为随复杂体系结构中的源和接收器位置而变化[25]，因此将比较每个参数的结果分布，比较2015年和2020年的RIR，比较下半部分的源和接收器位置中殿（两个数据集中的共同测量区域）。非线性衰减分析的结果（如图4c所示）反映了如图4a所示的混响时间的总体减少，同时也突出了存在非线性衰减时使用ISO参数的问题。结果显示，早期和晚期衰减率均下降，表明主要和次要“体积”均减小。在Notre-Dame的情况下，对不同声音音量的界定不如在耦合混响音乐厅设计中那样明显和明显。但是，由于其较高的天花板，可以将Transept与其他空间完全不同，而侧面区域（Transept除外）具有多个水平。由于拱形天花板中的孔位于收发器区域内（图3b），但是其中一个孔位于源/接收器区域上方，因此可以想象这种损坏会影响多个声学“体积”。在这些体积中衰减率的降低还导致弯曲点时间的减少，并在较小程度上降低了水平，并且应注意，所有这些参数都与声耦合条件有关。 2015年情况的后期混响时间的可变性可能归因于空间的复杂性以及各种声学区域，这不仅导致了简单的双斜率衰减，而且导致了更高阶的耦合。需要进行进一步的分析和测量以进一步检查该假设。最后，根据Luizard等人的观点，考虑可感知的可检测性。 [20]，耦合条件下早期衰变率的平均正差（JND）约为7％至10％，是晚期衰变的两倍。同样，BPt的JND约为15％到30％，涵盖了此处观察到的差异。这样，可以确信地说声学条件的差异是清晰可听的。4.2. 空间分析空间房间脉冲响应（SRIR）可用于房间声学的比较方向分析。这里选择的方法是一种参数化方法，即空间分解方法（SDM）[26]。基于这样的假设，声场可以描述为一连串的平面波，因此SRIR可以分解为一组离散的压力值及其对应的到达方向（DOA），即图像源为归因于每个时间样本。为此，将一个以目标样本为中心的小时间窗口应用于SRIR，并通过最小二乘解估计到达时间差（TDOA）的DOA。理想情况下，使用阵列中心的全向脉冲响应来分配压力值。该方法已用于音乐厅SRIR的分析和声音化[27]，也用于其图形表示[28]。这些工具在MATLAB软件包SDM Toolbox [29]中实现。SDM分析应用于使用相同3D四面体麦克风阵列进行的2015年和2020年测量。使用A格式信号（代表接近重合心形麦克风的四面体阵列）估算DOA。对于所使用的麦克风，将分析窗口设置为最小允许大小，该大小是脉冲通过阵列传播所需时间的两倍，对于所使用的麦克风而言，大约为0.4毫秒。为了获得麦克风中心的压力值，这是SRIR的图形表示所必需的，使用了后处理的B格式全向W通道信号，因为这种分配应应用于与方向无关的RIR。图5中显示了类似的源-接收器对位置的中值平面和侧面平面的结果。需要注意的是，在2020年，没有座位，地板空着。相比之下，2015年既有长椅，也有一些舞台上升器，椅子和乐谱架代表着音乐表演（见图2a）。在比较这些结果时，可以进行一些观察。(a)(b)图5. SDM分析显示了从0 ms到[10，50，100，200，300，500，1000] ms的累积能量极性分布曲线，带通滤波了100 Hz至5000 Hz，滑动平均值为5°。指示了源位置（红点）。 （a）SDM分析：状态2015，Src S2–Rec 1c； （b）SDM分析：状态2020，Src S1，建议16。从CNRS/MC为修复巴黎圣母院而采取的科学行动的数字平台上获得的纵向截面，来源：Andrew Tallon进行的3D激光扫描（2016）。关于直接声音，2015年显示的声音既局部又清晰（略微升高，这与它的位置以及当时的声源都升高相对应）。地板反射不可见，可能是由于椅子和长椅的存在。到2020年，直接声音“波瓣”变得更宽广，不那么尖锐。检查侧视图图，直接声音（实际上是响应的初始0 ms到10 ms窗口）呈现出略微负向的升高。这可能是由于平坦的地板空了，在10毫秒的分析窗口内对地板的强烈反射进行了计数，从而降低和扩大了响应的早期部分。关于累积能量，在2015年，能量从各个方向相当平稳且均匀地增加，如后续能量轮廓曲线之间的规则径向间距所示，最大增加幅度为100至200 ms，因此反射以35至70的路径差到达米后的直接声音，主要归因于拱形天花板。横向能量的首次增加是在直接声音到达后的10到50毫秒内发生的，这与中殿中的列行以及侧阳台的反射相吻合。在平面和截面上，包含0到1000 ms的最终分析窗口在-10 dB的相对水平下相当圆。相反，如先前的分析所述，2020年的结果显示，在初始时间窗口之后，能量的阶跃函数降低更多，这表明在整个时间（尤其是在垂直方向）上都缺乏随时间的渐进反射累积。在所有方向上平均的200到1000毫秒之间的相对累积水平为2dB，比2015年的结果低2dB。5. 讨论与未来工作由于[13,14]中的数据与2015年的测量结果相当，因此可以得出结论，导致更短混响时间估计的变化是在1987年至1996年之间进行的。由于巴黎圣母院大教堂的体积相当大，混响时间差必须是实质性变化的结果。还可以考虑大气条件影响混响时间结果的可能性。然而，由于温度和相对湿度主要影响1000 Hz以上的混响估计[30]，因此可以将其排除为减少混响时间的原因。因此，地毯跑步者可能是候选人。自2019年毁灭性大火以来，混响时间的减少显而易见。使用扫频正弦波和脉冲源以及相对近端位置都观察到相同的差异。导致T20急剧降低20％的建筑元素仍有待验证。非线性衰减率或耦合声量分析突出了这样一个事实，即变化的规模很大，影响了大教堂的不同区域，为此，拱形天花板上的孔可能是至少起重要作用的候选对象。后续工作将需要确定火灾损害相对于临时安装位置和残留杂物的声学影响。根据2015年的测量结果创建并校准了巴黎圣母院的几何声学模型，并根据2013年4月24日的音乐会表演记录[31]，制作了虚拟的音乐会重建模型[31]，未来大教堂的声学研究工作可以使用此计算机模型，最近的测量结果和模拟来使模型适应建筑物的发展状态。正如最近的研究表明，数值模拟用于研究复杂和耦合的声学条件[24]以及感知生存力[32]的可靠性一样，这种几何声学分析工作在大教堂中可以认为是可靠的。最初的工作将集中在2020年的火后状态，以归因于各种变化的声学影响。这些结果将提供给重建团队，然后可以将该模型进一步用于评估项目期间建筑重建建议的声学影响。声学模型可用于研究重建过程中可能的演化，其自850年前建造以来，还可用于探索巴黎圣母院的声学演化。几个世纪以来，大教堂的许多元素发生了变化，从法国大革命期间发生的各种建筑翻新和破坏到用于不同活动的各种装饰，无论是宗教的政治，政治以及整个季节，巴黎大教堂圣母院的音响效果在整个历史上都不是一成不变的，而是其环境和人类占领的不断发展的无形产物。结合历史研究成果，声学模型和相关的虚拟模拟可用于探索和体验这些先前的状态[33]。作者贡献：概念化，B.F.G.K.和A.W .;方法学，B.F.G.K.和A.W .; B.F.G.K.软件；验证，B.F.G.K。和A.W .;形式分析，B.F.G.K。和A.W.; B.F.G.K.调查和A.W .;资源，B.F.G.K.;数据策划，B.F.G.K .;写作-原始草案准备，B.F.G.K。和A.W.;写作-审查和编辑，B.F.G.K。和A.W .;可视化，B.F.G.K.和A.W .;监督，B.F.G.K .; B.F.G.K.项目管理；资金获取，B.F.G.K.所有作者均已阅读并同意该手稿的发行版本。资金来源：这项工作的部分资金来自“尚蒂尔圣母大学”，而CNRS跨领域和跨学科研究计划（MITI）也投入了资金。欧盟JPI文化遗产项目PHE提供了额外的支持，以探索建筑声学和音景的文化遗产。这项工作的2015年阶段部分由法国ECHO项目（授权号ANR-13-CULT-0004），echo-projet.limsi.fr和BiLi（授权号FUI-AAP14，www.bili-project）资助.org）。致谢：特别感谢巴黎圣母院的工作人员在测量过程中的协助和耐心。我们还要感谢MichèleCastellengo提供了1987年音乐实验室的原始数据录音，该录音是应文化部长的要求而进行的。感谢2015年测量期间Bart Postma，Julie Meyer和Jean-Marc Lyzwa（CNSM）的协助。特别感谢Tapio Lokki对SDM分析的讨论，以及FrédéricBilliet对Notre-Dame音乐史的贡献。最后，我们要感谢Escadrone在租用2020年测量中移动设备所需的机器人方面的帮助和指导。 参考文献可在原文中查看点击：查看更多分类文章 免费试用文档翻译免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网站无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。 来源于：MDPI
2020-12-25 18:30:44
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吸烟对立即种植牙稳定性的影响-前瞻性病例系列研究（结论
吸烟对立即种植牙稳定性的影响-前瞻性病例系列研究（上）4.讨论区当前的研究结果表明，吸烟者在美学上立即植入后以及上颌骨的后部区域对植入物稳定性有负面影响。假体加载18个月后，两组之间植入物周围的边缘骨丢失无显着差异。牙科植入物的稳定性是实现适当愈合的关键因素，因此，植入物假体治疗的成功与否取决于骨的质量，植入物的性质以及手术技术[27,28]。在我们使用的植入物中，螺距为2.4毫米似乎很多，但双螺纹设计弥补了这一不足，单螺纹之间的最大距离为1.2毫米。由于可变螺纹设计在冠状部分更宽，在根尖方向更深，因此植入物的主要稳定性也得到了增强。结果，这可以提供很高的初级植入物稳定性，甚至在软骨头上。在美学区域进行的定期测试显示，吸烟者和非吸烟者在植入当天以及手术后24个月的植入物稳定性没有显着差异。尽管在进行假体加载时（手术后6个月），吸烟者的植入物稳定性比不吸烟者低。在上颌骨的后部区域，在植入当天以及之后的6个月内，吸烟者的稳定性较低。 Sanchez-Perez等。在比较吸烟者与非吸烟者时，发现PT值总体上没有显着差异，但是他们发现较高的Periotest值（较低的稳定性）与植入失败的风险增加相关。此外，与不吸烟者相比，吸烟者的治疗成功率显着降低（分别为84.2％和98.6％）。吸烟量的增加导致差异更加明显，因为每天吸烟超过20支的患者5年后的失败率升至30.76％[10]。 Mesa等。同样，吸烟者和非吸烟者的Periotest值也没有差异[9]。随访2年后，两组患者均未观察到植入失败。在上述研究中观察到的差异（描述了在已愈合的牙槽c中进行的植入）可能归因于不同类型的手术方案，因为我们的患者接受了异种骨替代物进行的即时牙槽骨内植入。越来越多的证据表明，植入物的过度活动性（超过约150微米的阈值）会抑制骨整合过程，并可能导致在植入物与周围骨骼之间形成结缔组织层[29]。此外，基于二次稳定性测量，已经描述了可用的临床稳定性测量方法，例如Osstell设备中使用的共振频率分析，适合于预测植入失败的风险[30,31]。RFA和插入扭矩值代表了基本稳定性的两个不同特征，这一点非常重要。 RFA表示对弯曲载荷的抵抗力，ITV表示对剪切力的抵抗力[21]。在皮质骨较厚的情况下，ITV或RFA的测量可能会明显高估，这只能在与皮质骨接触的狭窄区域内提供植入物的初步稳定，而植入物可能无法在其中出现的部分中达到稳定。松质骨。在这些情况下，诸如VTW（可变扭矩功）或IE（插入能量）之类的动态测量方法对于确定实际力至关重要，植入物可以稳定在骨骼中。在我们的研究中，所有病例均立即植入新鲜的牙槽窝中，这意味着皮质骨缺失。根据Lekholm和Zarb分类，骨骼为III级甚至IV级[19]。这就是为什么RFA似乎是可靠的主要植入物稳定性评估方法，并且在这些骨骼状况下与VTW和IE相关联[32]。我们的结果显示，手术时后方吸烟者的平均ISQ值分别为60.4±0.4，不吸烟者后平均ISQ值分别为64.0±0.5和67.2±0.6。可以注意到，在上颌骨后部进行手术时，大多数吸烟者正处于即刻植入的边缘，而不吸烟者超出了这些要求，因此很容易推荐用于两阶段常规负荷植入。六个月后，应谨慎进行吸烟者植入物的装填（可能要使用几个月的临时未完全装满的牙冠），而非吸烟者的植入物可能会装上永久性的牙冠。我们的结果显示，在审美区域，手术时吸烟者的平均ISQ值分别为58.5±0.4，非吸烟者为60.0±5.1，负重时分别为65.52±5.05和67.61±5.11。可以注意到，在上颌骨的美学区域进行手术时，大多数吸烟者的状况低于立即植入的资格，而在大多数情况下，不吸烟者则符合这些要求。六个月后，应始终谨慎地吸烟者的植入物进行装载（使用暂时未完全装载的牙冠几个月），而非吸烟者似乎已准备好永久装载。通过共振频率分析测得的涉及植入物稳定性的先前研究结果是异质的。大部分的作者得出结论，烟草消费与植入物稳定性的差异无关[8,11,12]。 Badenes等人的最新研究。据报道，吸烟者不会影响主要植入物的稳定性，而吸烟者的次要稳定性可能会降低。此外，在愈合期间，在骨整合过程中，吸烟者的植入物稳定性下降了0.91 ISQ点，而在不吸烟者中，植入物的稳定性增加了2.69ISQ点[13]。另一方面，Sayardoust等。结果表明，在植入当天，手术后1天，7天和14天，吸烟者的植入物稳定性显着高于不吸烟者。但是，在植入后28天，两组患者之间的差异并不显着[14]。多样化的研究方案和手术程序阻碍了直接比较获得的结果。关于吸烟对植入物稳定性影响的可用结果存在很大差异，这表明需要进一步探索骨整合过程并澄清导致观察到差异的因素。Alfadda等人最近的荟萃分析。这表明吸烟每年平均使植入物周围的边缘骨损失平均增加0.11 mm [1]。其他荟萃分析证实吸烟者植入物周围的边缘性骨丢失增加[33,34]。在当前的研究中，18个月后的边缘骨丢失量低于上述荟萃分析中报告的大多数结果。这可能归因于不同的手术技术。在我们的研究中，假体负荷后18个月，吸烟者和不吸烟者在牙槽骨中观察到的边缘萎缩在上颌骨的美学区域和后部区域均无显着差异。在当前研究中，吸烟者和非吸烟者在植入物稳定性方面的差异在所有时间点都是相似的。基于ISQ值增加的植入物稳定性生长动力学的统计分析未显示两组之间的显着差异（美学面积p = 0.124，后部面积p = 0.188）。可以得出结论，在植入后的6个月内，吸烟并未明显影响骨整合过程本身。Sun等人的一项研究比较了吸烟者和不吸烟者之间的骨整合过程，结果表明，吸烟者植入后的愈合过程可能较慢。结果表明在植入后的最初几周内，最初获得植入物二级稳定性的时间延长。然而，在术后12周，吸烟者与不吸烟者之间的差异并不显着，这与我们的观察结果一致[11]。另一方面，萨亚库德（Sayardoust）表明，在植入当天，手术后1天，7天和14天，吸烟者中植入物的稳定性显着高于不吸烟者。但是，术后28天，两组患者之间的差异并不显着[14]。吸烟对骨骼代谢有负面影响，它阻碍了肺泡骨髓间充质干细胞的正常功能和增殖。赵等人的研究。结果表明，这些变化还与术后3周至6周吸烟者骨整合障碍和植入物稳定性降低相关[12]。由于我们的研究中使用了不同的手术技术（封闭式愈合），由于在手术后的最初几周内正在进行的愈合过程，因此无法进行植入物检查。通过测量植入后6个月的植入物稳定性，我们发现植入物稳定性生长动力学没有显着差异，这与上述研究一致。当前研究的局限性之一涉及稳定性评估的间接方法的使用。尽管ISQ指数与植入物微动度的大小有很强的相关性，但与之并不完全一致[35]。绝对微迁移率值的测量可能已提供了有关骨-植入物界面质量的更精确信息，并且可能已为吸烟者提供了骨整合过程的更广泛图像。迄今为止，还没有可用的设备可用于临床环境以评估实际的微动性。植入物的稳定性受多种生物学，机械和技术性质的因素影响。在我们的研究中，参数包括年龄，种植体直径，种植体记录长度，近中距和颊-骨尺寸的种植体角度，扭矩和边缘骨丢失。在美学领域，还评估了牙槽窝深度，钻孔深度和植入物在骨中的埋入水平。分别评估每个参数与稳定性测量结果的相关性，以控制研究结果的潜在混淆。Baltayan等人的研究。证明通过共振频率分析的植入物稳定性测量方法适合预测植入物假体治疗的风险-生存率与ISQ测量值相关。此外，记录的所有失败都发生在植入物加载时ISQ小于67时[36]。在我们的研究中，吸烟者在植入物当天的平均植入物稳定性在后部和前部区域均低于该水平。尽管在2年的观察期内生存率达到100％，但在吸烟者中观察到的植入物稳定性显着降低可能被认为是影响该组患者植入物长期预后的因素，因此采用较高的失败风险，例如立即或早期植入物，应谨慎使用，尤其是在存在其他风险因素的情况下[36,37]。在植入物加载之前执行的植入物稳定性测量可以帮助避免这种情况，在这种情况下，将超过适当的骨整合过程所需的阈值植入物稳定性水平。由于牙槽天然骨的存在，许多植入物被插入成角。这就是为什么在很多情况下，用于拧入上层建筑的技术孔会投射到冠的阴唇壁上的原因。特别是在美学区域，这是不可接受的。这就是为什么对所有患者均采用胶结的上层建筑以避免结果变化的原因。拟议的程序使得植入后24个月无法测量ISQ。在研究的这个时间点，我们只能使用Periotest。一些最新研究认为PT值是一种非常可预测的植入物稳定性测量选择，甚至与一段时间内的边缘骨丢失相关。常规的稳定性测量可能有助于植入假体治疗的长期成功[38]。 5.结论吸烟者与不吸烟者之间的主要和次要稳定性差异不大，但可能决定取消手术资格或推迟手术后6个月最终冠的交付，以及延长在吸烟者中临时冠的使用期限案件。与不吸烟者相比，吸烟者在上颌后部的即刻植入物的主要稳定性可能较低。与不吸烟者相比，在吸烟者中上颌骨的美学和后部区域，即刻植入物的次要稳定性可能较低。立即植入过程中，对更多的参与者进行了进一步的研究，并对牙周分析（例如，针尖深度，探查出血）和骨生物学（例如，骨密度分析，骨增加对植入物愈合和稳定性的影响）领域有了更深入的了解仍然需要吸烟者。参考文献1. 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2020-12-23 18:10:10
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吸烟对立即种植牙稳定性的影响-前瞻性病例系列研究（上）
吸烟对立即种植牙稳定性的影响-前瞻性病例系列研究（结论）来源于：MDPI皮奥特·维乔万斯基1（Piotr Wychowanski）1，†，安娜·史达文斯卡2（AnnaStarzyńska）2，*，†，芭芭拉·阿利卡（BarbaraAlicja Jereczek-Fossa）3,4，伊娃·伊瓦尼卡（Ewa Iwanicka）-格热格里克（PrzemysławKosewski）1，宝琳娜·亚当斯卡（Paulina Adamska）2和雅罗斯瓦夫·沃林斯基（JarosławWoliński）61波兰华沙Binieckiego街6号，华沙医科大学口腔外科，02-097； piotrwychowanski@wychowanski.pl（P.W.）; pkosewski@wum.edu.pl（P.K.）2格但斯克医科大学口腔外科系，波兰格但斯克80-211 Dbinbinki 街7； paulina.adamska@gumed.edu.pl3IRCCS，IEO欧洲肿瘤研究所放疗科，意大利米兰20-141 Ripamonti Street 435； barbara.jereczek@ieo.it米兰大学肿瘤与血液肿瘤系4，意大利米兰20-112，Festa del Perdono街7号5波兰华沙Binieckiego街6号，华沙医科大学，保守牙科系，02-097，波兰； ewa.iwanicka-grzegorek@wum.edu.pl6波兰科学院Kielanowski动物生理与营养研究所动物生理学系，波兰Jabłonna，Instytucka 3 Street，05-110； j.wolinski@ifzz.pan.pl*通讯：anna.starzynska@gumed.edu.pl;电话：+ 48-58-349-15-71†PiotrWychowański和AnnaStarzyńska同样为当前工作做出了贡献，应被视为共同第一作者。 收到：2020年11月17日接受：2020年12月19日发布时间：2020年12月22日 摘要：背景：吸烟显着影响牙周组织的生物学，并导致种植体周围疾病的风险增加。该研究的目的是调查吸烟是否会影响拔除后立即插入新鲜牙槽中的上颌牙植入物的主要和次要稳定性。方法：本研究针对164例年龄在27-71岁之间的患者进行。每天有67个人吸烟超过20支香烟，其中97人为不吸烟者。 190个即刻植入物被插入上颌骨。立即植入，同时用异种骨移植材料扩大牙槽。在后部区域，将植入物插入into骨槽中。植入物的稳定性使用插入扭矩值（ITV）和两种类型的设备进行测量：Periotest（PT）和Osstell（ISQ）。在锥形束计算机断层扫描中评估边缘骨丢失。结果：在美学领域，吸烟者在植入后6个月的PT值分别高于非吸烟者（p <0.05）。与非吸烟者相比，在植入后6个月，吸烟者的ISQ值显着降低（p = 0.0226）。与非吸烟者相比，在植入后一天（p = 0.0179），术后6个月（p = 0.0003）和术后24个月（p <0.0001），吸烟者的PT值均较高。 ， 分别。吸烟者在植入当天以及植入后6个月时的ISQ值分别低于未吸烟者（p = 0.0047）（p= 0.0002）。吸烟者和不吸烟者在负重后18个月，在美学以及后方区域的边缘性骨丢失没有显着差异（p>0.05）。吸烟者的ITV测量值在美学方面（16.3对17.5 Ncm）和后方区域（16.8对17.9 Ncm）比不吸烟者低。结论：这项研究表明吸烟对上颌即刻植入物的稳定性有负面影响。与不吸烟者相比，吸烟者在上颌后部的即刻植入物的主要稳定性可能较低，这可能会使吸烟者从该区域的即刻植入物中消除。与不吸烟者相比，在吸烟者的美学和后方区域，即刻植入物的次生稳定性可能较低，这可能会鼓励在手术后6个月推迟最终冠的分娩，并且在某些吸烟者中会延长临时冠的使用时间。 关键词：立即植入；植入物稳定性抽烟;牙种植体的危险因素；周期测试奥斯特尔 1.介绍吸烟被认为是植入物假体治疗的危险因素，因为吸烟者中植入物的失效率几乎是非吸烟者的2倍[1]。最近的荟萃分析表明，吸烟的效果与剂量有关，每天吸烟20支以上的患者的植入失败风险高4倍[2]。香烟对头颈部区域伤口愈合的多方向影响，对骨整合过程的影响以及对口腔微生物组组成的影响，均会影响植入治疗的效果[3-5]。植入物的稳定性是骨整合过程中的关键因素。通过植入物表面和骨骼之间的机械力获得的原始植入物稳定性主要取决于植入物的设计和尺寸，骨骼结构和插入规程。二级植入物的稳定性在植入物骨整合后获得，并由骨组织与植入物表面之间的生物连接构成[6]。植入物的稳定性是适当骨整合的前提，因为植入物的过度微动性可能会破坏与钛螺钉接触的骨骼的形成，并可能导致植入物的纤维包封[7]。关于吸烟者中牙种植体稳定性的文献有限。先前的大多数研究报告表明，完全整合骨后，吸烟对植入物的稳定性没有显着影响[8-12]。最近的一项研究表明，吸烟者的稳定性较低[13]，而另一项研究表明，吸烟者的基本稳定性可能高于不吸烟者[14]。一些研究人员发现，烟草的使用可能会改变骨整合的过程，吸烟者获得次生稳定性的过程可能会较慢[11,12]。与吸烟者中的植入物稳定性有关的现有证据很少。异类结果似乎是矛盾的。所有上述研究均评估了以常规方式在愈合的牙槽骨c中插入的植入物。如今，有许多新技术可将种植体放置在同时再生的骨骼，骨种植体中，或将拔牙后的种植体直接放置在新鲜的窝中[15-17]。迄今为止，尚无研究评估抽烟后立即插入新鲜牙套中的即时植入物在烟民中的稳定性。此外，大多数现有研究是根据采用开放式植入物愈合模型的一步法进行的。种植体插入的前后区域之间没有比较[8-11,13,14]。当前的研究集中在插入美观的即刻植入物以及上颌骨的后部区域，在该区域中所有植入物均经历了封闭的愈合过程。这项研究的目的是通过共振频率分析（RFA）客观比较吸烟和非吸烟患者上颌骨前后区域立即种植体的主要和次要稳定性（种植体插入后6和24个月）。和阻尼能力（PTV）。 2.材料和方法2.1.学习规划前瞻性病例系列研究是在波兰华沙医科大学口腔外科进行的。该研究包括164名患者。研究参与者是在2012年至2015年（进行手术）期间招募的，观察期为两年。患者被告知研究目的并获得知情同意。该研究得到华沙医科大学生物伦理委员会的批准，许可号：KB / 278/2012。 纳入研究的标准如下：没有慢性疾病，没有服用任何慢性药物，在口腔其他部位缺乏局灶性感染，正常的口腔卫生，因龋齿而掉牙的患者的健康患者问题，牙周炎，牙齿破裂和吸收。排除标准如下：中度吸烟者（少于20包年），磨牙症，咬合副功能（例如，紧握，打磨，敲打牙齿，咬住嘴唇和脸颊的粘膜，咬指甲和口香糖），牙槽缺损插座壁，前庭骨板除外。在存在慢性根尖周炎的情况下，患者符合延迟植入方案的条件，因此未纳入研究。 2.2.植入物功能使用了SPI植入物（Alpha-Bio Tec。，以色列Petah Tikwa）。 SPI是一种有源螺旋植入物，推荐用于D3和D4骨，其高螺距为2.4 mm。 SPI具有自钻，自攻和自凝结特性。具有六角连接2.5毫米，获得专利的NanoTec表面，高BIC（骨植入物触点）和平台切换。所使用的植入物的特征是略微渐缩的主体和逐渐变细的芯，即比主体更明显的特征。 2.4毫米步距的双螺纹设计与可变螺纹设计一起使用：冠状-较厚的方螺纹，中-较细的方螺纹和顶-V螺纹。螺纹深度沿顶端方向增加。同时用牛异种骨替代材料（颗粒直径为0.5–1 mm； Alpha-Bio的天然骨移植物，Alpha-BioTec。，以色列Petah Tikva）来增强肺泡。 2.3.外科手术术前常规进行锥束计算机断层扫描（CBCT）扫描，以评估植入物的未来位置并确认牙槽骨壁的完整性。记录参数，例如植入物直径和长度，插入角度，扭矩，牙槽窝深度，钻孔深度以及植入物在骨中的嵌入水平。没有评估骨的密度。外科手术由P.W.获得最佳口腔卫生后，从手术前一天开始，每12小时给予植入物，覆盖抗生素并口服口服Augmentin（875 mg阿莫西林和125 mg克拉维酸），每7小时给予一次。使用在1 mL溶液中包含40 mg盐酸阿卡替丁和0.01 mg酒石酸肾上腺素的药筒进行浸润麻醉。在美学区域，使用脱模器和镊子对牙齿的创伤最小。立即使用SPI植入物进行植入，并根据制造商的说明插入植入物。同时用直径为0.5–1mm的牛异种骨替代材料增强肺泡（以色列以色列Petah Tikva的Alpha-Bio公司的天然骨移植物，Alpha-Bio公司）。仅在牙槽的边界内进行美学区和后区的增强。前牙区缺失的牙齿通过马里兰州的粘性牙桥暂时修复。在后部区域，根据Wychowański等人描述的方法立即植入植入物。 [18]。去除冠和根部分离后不久，用脱模器和镊子进行无创伤性拔牙。提取后的牙套被彻底刮除。颊和pa的肺泡中都充满了牛异种物质（颗粒直径为0.5–1 mm，Alpha-Bio的天然骨移植物）。然后，使用直径增大的工具手动准备in上牙槽中的植入床，以使生物材料凝结并扩大植入床。根据制造商的说明插入了SPI植入物（Alpha-Bio Tec。，以色列Petah Tikva）。进行对照CBCT扫描，并使用手术骨水泥（Septo-Pack，Septodont，法国巴黎）。所有植入物均进行了6个月的闭合愈合[18]。在美观区域，插入了129个长度为11.5、13或16毫米，平台直径为3.3、3.75或4.2毫米的植入物。在后部区域，插入了61个长度为10或11.5 mm，直径为3.75或4.2的植入物。每个患者接受1或2个植入物。根据Lekholm和Zarb分类，在所有植入部位均发现了III级和IV级骨[19]。表1详细介绍了研究参与者的特征。 2.4.术后护理在手术后30分钟，如果出现疼痛，则再次给患者服用500mg布洛芬。指导患者吸烟对植入物稳定性和伤口愈合的负面影响，并指导患者术后2天避免吸烟。建议患者每天两次用含0.12％洗必泰的溶液漱口，持续2周。每年进行两次涉及去除细菌生物膜和牙结石的专业预防程序。所有植入物的上层结构均为单一单位的牙冠。我们在锆的基础上进行了陶瓷冠。我们使用Maxcem Elite自蚀刻和自粘树脂胶（Kerr Italia）在锆基台上固定牙冠。表1.研究参与者的特征。 2.5.稳定性测量使用两种设备测量了牙植入物的稳定性：Periotest Classic（德国Modautal的Medizintechnik Gulden）和Osstell Mentor（瑞典的哥德堡Osstell）。在植入当天，6个月后（在假体加载当天）和植入后24个月后再次进行稳定性测量。由于存在粘结的假体上层结构，植入后24个月未使用Osstell仪器进行稳定性测量。Osstell Mentor设备使用共振频率分析（RFA）来评估植入物的稳定性。该设备以磁性方式感应植入物的振动并测量其移动频率。结果用ISQ量表（值：从0到100 – ISQ值的增加与植入物稳定性的提高相关[20,21]。根据生产商手册和研究数据，ISQ的测量值主要有四个范围：小于60（由于植入物稳定性低，请考虑保守方法），60-65（建议分两阶段进行常规加载），65-70（一可能需要提前阶段进行加载，并且应超过70（建议一阶段立即加载）[22,23]。在颊舌和前后平面中进行了三次测量，并对结果取平均值以最小化测量误差。最终的ISQ结果是从两个平面获得的值的平均值。Periotest Classic设备的设计旨在通过测量敲击过程中监测杆尖端与被测表面之间的接触时间来识别植入物的阻尼能力和刚度。使用范围从-8到+50的PTV（周期值）单位表示结果，其中较低的PTV与植入物的较高稳定性相关[24]。通过垂直于愈合基台或义齿冠的长轴在其最顶端点应用设备的尖端进行测量。在颊舌平面中重复测量三次，并将结果取平均值。在植入当天，使用OsseoCare Pro钻孔装置Bien Air Dental测量插入扭矩值（ITV）。 2.6.边缘骨丢失测量使用CBCT评估可重复方式在种植体的中，远侧以及lat和前庭方面的边缘骨丢失情况，以评估牙槽骨[25,26]。使用Kodak3000C3D CBCT设备（柯达牙科系统，美国佐治亚州亚特兰大），使用版本为6.12.32的Dental Imaging软件，在假体加载当天（植入后6个月）和假体修复后18个月进行测量。柯达牙科系统公司，美国乔治亚州亚特兰大）。从植入物的肩部水平到最近的骨水平进行测量。扫描在两个平面上进行评估：颊-骨（在颊侧上进行一次测量，在植入物的side侧上进行一次测量）和近中距（在种植体的内侧上进行一次测量，在植入物的远端上进行一次测量）。记录的结果是四次测量中最高的。进行测量的研究者对于患者被分配到哪一组视而不见。分析材料的顺序是随机的，以补偿测量过程中学习曲线中的潜在偏差。边际骨损失测量和植入物稳定性测量都是如此。 2.7.统计分析对于两个研究组，使用d（效应量）= 0.85，使用G * Power软件版本3.1.9.4在α= 0.05且80％功效下进行单尾t检验，估计样本量。达到d值为0.85假设最小增量= 0.51，最大SD = 0.60。 SD是根据我们以前的研究获得的。一组的推荐样本量为18例。所有数据均表示为平均值和标准偏差。首先使用Kolmogorov-Smirnov检验检查数据的正态性（数据未显示）。使用未配对的t检验或Mann-Whitney检验（某些数据不是正态分布）比较两组（吸烟者和非吸烟者）之间的差异。如果可能，对显着性检验进行2-尾检，并以0.05的显着性水平进行。皮尔逊检验用于测量变量之间的相关性分析。没有丢失的数据。 3.结果3.1.患者特征这项研究针对164位患者进行：74位男性和90位女性，年龄在27至71岁之间（平均年龄49岁）。该组患者包括67名患者，他们每天至少抽烟20支，吸烟时间至少10年（超过10包年-重度吸烟者），还有97人不吸烟（从未吸烟）。经过2年的观察，植入物的存活率为100％。由于吸烟是牙周炎发展的危险因素之一，因此记录了拔牙的原因，研究组在这方面保持一致。后牙区吸烟者和非吸烟者由于牙周病而拔牙的百分比分别为8％和16％，而在美容区，由于牙周病而拔牙的比例分别为9％和9.5％。研究人群仅限于符合资格标准并在2012年至2015年期间入院的一组患者。总体上，对674例患者进行了资格评估，由于一般慢性疾病而排除了251例患者，其中3例常规服用了镇静剂药物治疗，114例口腔活动性感染，117例磨牙症/咬合副功能障碍和23例患者不能保持适当的口腔卫生。总体而言，本研究排除了508名患者，166名受试者符合纳入标准。所有参与者的随访期均为2年。没有患者失去随访，有2位患者在随访期间戒烟，因此被排除在研究之外。牙齿脱落的原因列于表2。表2.牙齿脱落的原因。3.2.审美领域植入当天，两组之间的Osstell测量值没有显着差异。植入后6个月，吸烟者的平均Osstell测量值显着降低（稳定性较差）（p=0.0226）。植入当天和植入后24个月在美学区域进行的骨灰质素测量结果显示，吸烟者与非吸烟者之间的植入物稳定性没有统计学上的显着差异（p> 0.05）。与不吸烟者相比，吸烟者在植入后6个月的平均Periotest值较高（稳定性较低），分别达到0.34（±0.12）和0.0（±0.09，p = 0.02）。吸烟后18个月，吸烟者和非吸烟者之间在美学区域的植入物周围边缘骨水平无显着差异（p = 0.94）。此外，两组之间的前庭骨板厚度保持相同。结果显示在图1和表3中。吸烟者在后方区域的ITV测量值低于不吸烟者，但未显示出统计上的显着差异，如表1所示。统计分析表明，ITV与吸烟者之间呈正相关。在所有研究组中，periotest（PT）以及ITV和ISQ均无统计学意义。图1.在上颌骨立即植入后，吸烟者和非吸烟者的美学区域中的植入物稳定性。3.3.后区在植入当天（p = 0.0047）以及植入后六个月（p = 0.0002），吸烟者后方的平均Osstell测量值均低于非吸烟者。与不吸烟者相比，在吸烟者中，植入后一天的平均围发期值较高（稳定性较低）（p = 0.0179），植入后6个月（p =0.0003）和植入后24个月（p <0.0001）。植入后18个月，后区的边缘骨丢失量在各组之间无显着差异（p = 0.49）。结果显示在图2和表4中。吸烟者的上颌后部ITV测量值比不吸烟者低，但未显示出统计学上的显着差异，如表1所示。统计分析表明，吸烟者与吸烟者之间存在正相关。在所有研究组中，ITV和PT以及ITV和ISQ均无统计学意义。 图2.在上颌骨立即植入后，吸烟者和非吸烟者后部区域的植入物稳定性。 3.4.其他分析使用Pearson检验对测量变量（Periotest值，ISQ值和骨萎缩）与其他变量（年龄，植入物直径，植入物长度，植入物成角度和插入过程中的扭矩，牙槽窝深度，钻孔深度，和植入物在骨头中的嵌入程度）。在研究的组中，与PT值或ISQ相关的唯一变量是种植体长度，种植体直径和扭矩。这些相关性与文献[24]中以前发表的数据一致。分析了随时间推移植入物稳定性的动态变化，以分析吸烟者与非吸烟者之间的潜在差异。在美学和后部区域之间没有发现显着差异（分别为p = 0.124和p= 0.188）。 点击：查看更多生物学文章免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息，仅代表作者个人观点，与本网无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。
2020-12-23 18:00:00
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将下一代免疫肿瘤生物标记物带入临床
来源于：MDPI亚历山德拉·切萨诺*和莎拉·沃伦 【摘要】免疫疗法治疗癌症的最新成功导致了许多新化合物的开发。需要新型的临床级生物标志物来指导这些药物的选择，以获得患者受益的最大可能性。用于免疫治疗的预测性生物标志物与用于靶向治疗的传统生物标志物不同：与使用单个分析物生物标志物相比，免疫反应和肿瘤生物学的复杂性需要更全面的方法。本文综述了有效开发免疫肿瘤疗法的新型生物标志物方法，强调了下一代基因表达谱分析技术的发展前景，该技术可以有效地组织和解释生物学信息，从而在个体患者水平上发挥最大的预测价值。 关键词：生物标志物；免疫疗法免疫肿瘤学PanCancer IO360；基因表达谱基因表达签名纳米线1. 介绍 免疫疗法已被证明是治疗各种晚期和转移性癌症的有效方法[1]。然而，尽管第一波针对免疫调节剂的抗体的临床成功是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）和程序性死亡配体1（PD-L1）和程序性细胞死亡蛋白1（PD-1） ，只有部分未选患者表现出持久反应[2]。此外，当在非选择或次优选择的患者群体中将这些药物作为单一药物在早期治疗中进行测试时，该领域正在见证3期试验的显着失败[3-7]。最后，初步数据表明，尽管这些药物的组合在某些情况下很有希望，但与毒性和成本增加相关[8,9]。免疫肿瘤学靶标的数量很高并且还在增长，针对这些靶标的治疗剂的潜在组合以及此类试剂与常规护理标准剂的组合的数量甚至更多。因此，要完全实现这种抗癌方法的潜力，就需要开发和实施新型的临床级生物标志物，以指导选择具有针对多种耐药和免疫逃逸机制的互补作用机制的药物。本文将从机械学的角度讨论旨在通知有效药物开发的新型生物标志物方法，以及免疫疗法的临床实施（即患者富集）。 2. 理想的免疫肿瘤（IO）患者浓缩选择（即“预测性”）生物标记物的必要功能肿瘤学中的生物标志物可大致分为预后性和预测性。预后生物标志物定义为生物标志物，用于识别临床事件作为疾病自然史的一部分的可能性，例如患有疾病或所关注疾病的患者的疾病复发或进展[10]。这些生物标志物有助于告知患者有关复发风险或中位生存期，也可用于临床试验的前瞻性分层。预测性生物标志物定义为用于鉴定更可能从某种治疗中受益的患者亚组的生物标志物。相对于未选择的人群，仅用生物标志物定义的亚组中的相关治疗药物治疗那些患者应可提高疗效的可能性。此外，无法预期会受益的患者不会接受潜在的毒性治疗，因此可以转诊为更可能有效的治疗。在靶向抗癌治疗领域，药物作用机制包括直接干扰已确定的致癌驱动因子（例如表皮生长因子（EGF）受体或人表皮生长因子受体2（Her2）表达），单一分析物生物标志物传统上，临床上一直使用直接测量肿瘤细胞上药物靶标是否存在的方法来鉴定可能从靶向治疗中受益的患者亚群。对于免疫肿瘤学（IO）药物，即作用于宿主免疫系统的药物，情况截然不同，这些药物最终构成“疗法”，即与肿瘤作斗争。癌症中的免疫反应反映出一系列精心调节的事件，这些事件可以自我传播（由梅尔曼和陈定义为癌症-免疫周期[11]）。这个周期的每个步骤都需要协调许多因素，包括刺激性和抑制性。这就是为什么对癌症免疫过程的评估理想地应全盘考虑而不是单个要素来解决的原因。在患有癌症的患者中，癌症的免疫周期不能达到最佳状态。但是，任何给定患者中的一个或多个限速步骤可能不同。由于癌症免疫疗法的目标是启动或重申癌症免疫力的自我维持循环，使其能够放大和传播抗癌反应，因此最有效的方法将涉及选择性靶向任何给定患者中的限速步骤。因此，需要生物标记物在个体患者水平上鉴定障碍和基础生物学，以指导适当的治疗干预。现在已经认识到，癌症-免疫相互作用受到一组复杂的肿瘤遗传和表观遗传因素以及宿主基因组和环境因素的影响，它们共同起作用，共同控制着抗癌反应的强度和时机。由于免疫反应和肿瘤生物学的复杂性，单一分析物生物标志物的信息量不是很高。由于技术的飞速发展，今天，我们可以使用技术平台来测量影响癌症与免疫相互作用的因素，这些技术平台可以分别测量不同类型的潜在信息分析物（DNA，RNA和蛋白质）。免疫肿瘤学（IO）转换研究中当前的基本挑战仍然是可从小型临床样本中获得的有用信息量，以及如何轻松，及时地将数据整合为生物学和临床可行的信息。3. IO治疗的批准和候选生物标志物检查点抑制剂的开发在利用免疫系统排斥肿瘤方面取得了里程碑式的成就，为强大的新型遗传分析工具为免疫肿瘤学带来革命性发展奠定了基础。检查点抑制（即针对适应性外周免疫抑制相关通路的抗体，例如CTLA-4，PD-1和PD-L1）是一种特别有前途的抗肿瘤策略，似乎在许多类型的肿瘤中都具有临床意义。此外，记忆性T细胞反应的产生可提供长期免疫力，这已被临床观察到的广泛反应所证实。此外，在对癌症免疫相互作用的生物学机制有了更深入的了解的基础上，涌现了一系列针对活化和抑制性T细胞受体的新免疫疗法，包括组织浸润淋巴细胞（TIL）在内的过继细胞疗法（ACT），嵌合体抗原受体（CARs），T细胞受体（TCR）修饰的T细胞和双特异性抗体现已通过临床评估，其中两种嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）产品最近在美国被批准用于治疗难治性血液系统恶性肿瘤（特别是急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤）的患者亚组[12-14]。以下各节回顾了目前正在使用和正在研究中的与检查点抑制剂一起使用的生物标志物，主要是针对PD-1和PD-L1的生物标志物，因为临床上有用的生物标志物可预测对CTLA4治疗的反应仍未得到满足。另外，针对肿瘤内不同细胞群体的不同生物标志物也正在作为其他免疫治疗方法的IO生物标志物进行研究，但仍处于开发的早期阶段，例如调节性T细胞（Tregs），淋巴细胞活化基因3 9LAG-3），骨髓来源的抑制细胞（MDSC）和吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）。时间将证明这些分子是否将在临床中发挥作用。最后，开发用于癌症疫苗和CAR-T治疗的预测性生物标志物的工作也在进行中，但仍在初步阶段。在这方面，表征治疗前免疫状态的生物标志物显示出了希望，在某些情况下，已经鉴定出基因签名，这些标志似乎是有益于应答的免疫状态的有用指标[15,16]。4. 通过免疫组织化学（IHC）测量靶标由受体PD-1及其配体PD-L1和PD-L2组成的信号轴是T细胞功能的负调节剂。 PD-1的作用是抑制周围持续进行的免疫反应，以控制感染和炎症后的组织损伤。目前，已批准针对PD-1或PD-L1的多种抗体，主要用于治疗晚期转移性癌症，包括转移性黑素瘤，转移性非小细胞肺癌（NSCLC），复发或转移性头颈癌，难治性经典霍奇金淋巴瘤，尿路上皮癌，胃癌和带有生物标记物的癌症被称为高微卫星不稳定性（MSI-H）。对于这些疗法（后者除外），迄今为止，PD-L1IHC是评估的主要诊断方法。不幸的是，迄今为止的实践是使用不同的抗体，平台，评分系统和临界值独立开发抗PD-L1 IHC诊断测定。结果，当前的治疗和诊断矩阵对临床中的测试和决策提出了复杂的挑战。除了当前的PD-L1 IHC分析存在的问题外，PD-L1作为单一分析物的生物标志物还具有以下缺点：主要是细胞，空间和时间异质性，所有这些都导致较差的预测准确性（尤其是较差的阴性预测值）这种生物标志物在临床中的应用[17]。此外，PD-L1表达与预后的关系尚存争议，并且在肿瘤类型之间也不同[18]。最后，即使在高度选择的人群中，也只有不到四分之一到一半的患者从抗PD-1或抗PD-L1治疗中获得了临床益处。对反应的更准确预测可能取决于对复杂且不断发展的肿瘤免疫微环境的更多信息量度，并且可能涉及多个分析物。5. 测量肿瘤抗原性：肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性（错配修复缺陷）与多种癌症类型的免疫疗法反应相关的生物标志物是肿瘤突变负荷。ipiplimumab在晚期黑色素瘤的研究中首次观察到突变负荷与对免疫检查点抑制剂（在这种情况下为CTLA-4阻断剂）的反应之间的关联[19,20]，这增加了肿瘤的遗传环境可能影响肿瘤的可能性。免疫疗法提供的临床益处。肿瘤突变负荷是肿瘤基因组内突变数目的量度，其定义为肿瘤基因组每个编码区域的突变总数。肿瘤类型中突变负荷的变异性很大，范围从几个突变到数千个突变。低级和儿科恶性肿瘤的突变负荷最低，而与环境DNA损伤相关的上皮癌的突变程度最高。例如，在非小细胞肺癌患者中，从未吸烟者的肿瘤的体细胞突变比吸烟者肿瘤的体细胞突变少，而吸烟者的肿瘤可能具有10倍以上的突变[20]。研究表明，高的肿瘤突变负荷与黑色素瘤[19,21]，NSCLC [22,23]和尿路上皮癌[24]对检查点抑制剂的较好应答率相关。在对抗PD-1和抗PD-L1药物表现出有限反应的肿瘤类型中观察到较低的肿瘤突变负荷，例如大肠，卵巢和前列腺肿瘤[25]。肿瘤突变负荷可以通过全外显子组测序来确定，但是由于其成本高和生物信息学要求高，因此在临床上无法广泛使用该方法。因此，人们正在努力开发从广泛使用的下一代测序基因组中准确估算总突变量的方法。研究表明，整个基因组的突变负荷可以通过对只有几百个基因的小得多的序列进行测序来推断[26-28]。可以使用靶向测序小组估计突变负荷，其准确性与使用全外显子组测序报道的准确性相似[27,29]。例如，Foundation One测试（Foundation Medicine，美国马萨诸塞州剑桥市的Foundation Medicine）是一种经过验证的靶向测序方法，可以表征已知在实体瘤中发生突变的324个基因中的突变。因此，该测试于2017年12月获得FDA的批准，可检测先前出于临床管理目的被诊断患有任何类型实体瘤的患者的肿瘤中的突变，包括在某些癌症类型中选择适当的FDA批准的治疗方法。作为实验室开发的测试，Foundation One分析还用于证明突变负荷预测尿路上皮癌[30]，黑素瘤[31]，肺癌[32]和结直肠癌[ 33]，对于这种适应症，正在临床试验中对其进行前瞻性评估。高肿瘤突变负荷还与DNA错配修复途径的基因突变有关（黑素细胞刺激激素（MSH）2，MSH6，MutL同源1（MLH1），减数分裂后分离的2蛋白（PMS2）），微卫星不稳定性（ MSI）和DNA聚合酶（POLE）[29]。进一步支持高突变负荷和对免疫治疗的反应之间的关联，即错配修复（MMR）缺陷型肿瘤，其基因组包含大量体细胞突变，易受免疫检查点封锁[34]。通过全面的基因组分析测量的肿瘤突变负荷是一种重要的新兴生物标志物，在预测对免疫检查点抑制剂反应的能力方面显示出希望。需要进行进一步的研究以充分了解这种新型生物标记物如何补充当前的靶向免疫疗法及其在多种肿瘤类型中的应用。将肿瘤突变负荷与其他参数（例如基因和蛋白质表达，新抗原，MSI状态和免疫靶标）结合起来的多成分预测生物标志物系统，可能需要使医生更准确地选择将从这些疗法中受益的患者。2017年，派姆单抗被批准用于治疗患有不可切除或转移性实体瘤的患者，这些患者已被鉴定为患有MSI-H或错配修复缺陷（dMMR），因此成为美国食品和药物管理局批准的首项癌症治疗方法（ FDA（美国食品药品管理局（FDA）），而不是根据肿瘤起源细胞。根据新的FDA标签，dMMR的存在是成人或儿童中任何不可切除或转移性实体瘤中使用检查点抑制剂派姆单抗的充分指示。由于实验室开发的测量dMMP或MSI-H的检测方法可作为与熟悉的结直肠癌相关的遗传综合征的一部分进行常规检测，因此未同时批准互补或伴随诊断方法。6. T细胞的定量和表征通过浸润免疫细胞表达PD-L1的潜在重要性[17]，CD8 +肿瘤浸润淋巴细胞的存在和位置[35]以及肿瘤免疫中的其他因素，目前正在研究微环境[36]，以识别临床结果的更敏感和更具体的预测因素。在许多类型的肿瘤中，相对于没有免疫浸润的肿瘤，肿瘤浸润淋巴细胞的存在与预后的改善有关。基于IHC的结肠癌Immunoscore®测定法（IS Colon； HalioDx SAS，法国巴黎）是在结肠癌的背景下开发的，众所周知，结肠癌是具有免疫原性的，可通过测量体内免疫反应来评估宿主的免疫反应-和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片中肿瘤周围T细胞浸润。评分系统源自免疫情况（不同肿瘤区域内适应性免疫细胞的类型，功能方向，密度和位置），并且基于两个淋巴细胞群体（CD3，CD8或CD8，CD45RO）的测量在肿瘤的核心和浸润边缘。 Immunoscore已显示是结直肠癌的临床有用的预后标志物[37]，并且正在其他肿瘤中进行研究，作为对检查点抑制反应的预测指标。除了枚举肿瘤内的T细胞外，表征T细胞群体的克隆性作为推断肿瘤反应性T细胞克隆扩增的一种方法也可能是有益的。免疫测序是一项能够对T细胞和B细胞谱进行分析的技术。对于给定的T细胞克隆，重排的CDR3序列是唯一的，并且随着该克隆响应抗原刺激而扩增，其流行率会增加。免疫测序法可捕获特定的单个克隆以及完整的CDR3库。该技术可作为一种商业化的检测方法ImmunoSeq（美国华盛顿州西雅图市的自适应生物技术公司）使用，尽管在这种情况下尚未确定其临床实用性。在使用派姆单抗治疗后，ImmunoSeq已被用于对转移性黑色素瘤患者肿瘤内的T细胞谱进行测序，以检测应答者与非应答者之间所得免疫谱的差异[37]。来自应答者的预处理样品显示出更高的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）比例和更高的克隆性，而来自非应答者的样品显示出更低的TIL水平和更大的多样性。7. 基因表达签名与在很大程度上保持恒定的肿瘤中的突变基因相反，免疫反应是动态的并且迅速变化。因此，癌症免疫治疗领域面临的问题是如何衡量不断发展的免疫反应，识别有助于临床获益的免疫反应以及通过联合疗法朝着这个方向推动每个患者的免疫反应。基因表达签名可能是最丰富的诊断信息来源。基因表达签名是一组提供信息的基因的组合表达模式在诊断，预后或预测治疗反应方面。在免疫肿瘤学中，使用基因表达谱特征，可以鉴定出晚期实体瘤的两个主要子集：• 大约三分之一的肿瘤具有T细胞发炎的肿瘤微环境特征（T细胞标志物，趋化因子，巨噬细胞激活的抗原，I型干扰素（IFN）转录谱），显示出预先存在的适应性免疫反应，因此提示该表达局部抑制因素的作用对于这种类型的肿瘤，有助于制止外周耐受的药物在临床上更有可能成功。• 非T细胞发炎的肿瘤无T细胞浸润，提示缺乏先天免疫激活或T细胞运输受阻。这些肿瘤需要通过克服中枢耐受性或通过操纵干扰T细胞贩运的致癌基因信号通路来激活先天免疫应答的治疗方法。目前，尽管所有开发检查点抑制剂的主要公司都在使用不同的研究级检测方法，但尚无批准的检测方法来测量肿瘤炎症水平[38]。一种基因签名，即肿瘤炎症签名（TIS），已被开发为一种临床级的检测方法，可提供有关肿瘤炎症特征的定量和定性信息。肿瘤内的免疫环境，报告免疫浸润的存在以及T细胞的功能状态。在NanoStringnCounter®基因表达系统（NanoString Technologies，Inc.，西雅图，华盛顿州，美国）上开发的TIS是一种18个基因的标记，可测量肿瘤内外周抑制的适应性免疫应答[2]。 TIS包含与抗原呈递，趋化因子表达，细胞毒活性和适应性免疫抗性有关的IFN-γ反应基因。TIS是默克公司开发的一种临床级试验方法，用于预测对派姆单抗的免疫反应[2]。通过一系列培训活动，首先使用来自黑色素瘤的临床试验样本，然后扩展到其他肿瘤类型，开发并发展了该测定法，以定义10种癌症（黑色素瘤，膀胱癌，胃癌，头癌）中由全肿瘤T细胞发炎的表型和颈部鳞状细胞癌（HNSCC），三阴性乳腺癌，肛管，胆道癌，结直肠癌，食道癌和卵巢癌）。随后的研究证明了TIS在其他临床环境中的价值，例如在新辅助环境中用ipilimumab加nivolumab治疗的黑色素瘤[39]，以及在ipilimumab高剂量干扰素治疗的黑色素瘤中的价值[40]。在HNSCC肿瘤中，相对于PD-L1 IHC，TIS具有更高的敏感性和更高的阴性预测价值，可检测出对派姆单抗的应答者。此外，在HNSCC中，突变负荷和TIS评分均独立预测了人乳头瘤病毒（HPV）和爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）阴性的患者对pembrolizumab的反应。然而，只有TIS评分在HPV阳性或EBV阳性患者中是可预测的，据推测，其中病毒致癌基因驱动肿瘤发生和免疫反应，且突变负荷较低[41]。基因表达分析的传统方法对于临床应用具有局限性。例如，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）一次测量一个基因的表达，而多重表达谱分析技术（如覆盖数以千计的转录本的微阵列）通常很昂贵，并且在评估低表达水平时缺乏灵活性和可重复性。高质量的RNA样品，例如FFPE样品。因此，能够从有限数量的劣质材料中进行生物标志物多重分析的平台非常有吸引力。Nanostring Technologies nCounter平台（美国华盛顿州西雅图的NanoString公司）是一种相对较新的技术，已在各种临床和研究应用程序中使用。自动化的nCounter平台可将荧光条形码直接与特定核酸序列杂交，从而允许在一个样品中对多达800个靶标进行非扩增测量[42]。上面讨论的TIS是在NanoString平台上开发的，可与pembrolizumab一起使用。随着基因表达签名变得越来越复杂，它们会产生更多可用于诊断，预后或预测治疗反应的信息。这些强大的检测方法利用了免疫系统的巨大多样性和灵活性，对于癌症的个性化治疗具有广阔的前景。图1提出了一个框架，用于组织要理想地在单个测定中进行测量和整合的生物学信息，以指导有效的药物开发和最终的临床实施。简而言之，人类的抗癌免疫力在组织学上可以分为三种主要表型：发炎的表型（也称为“热”表型），免疫排斥的表型和免疫-沙漠表型（后两种被认为是“冷”肿瘤）[ 43]。重要的是，每种都与特定的潜在生物学机制有关，这些机制可能阻止宿主免疫反应根除癌症。因此，在个体患者的水平上识别这些机制对于当前和新的治疗方法的开发和临床实施都是至关重要的。Ayers等人描述的TIS基因表达谱分析算法。 （2017）[2]是此决策树的基础。然而，尽管有必要，但适应性免疫反应的存在并不总是足以对PD-1–PD-L1封锁做出反应。可能存在周围免疫抑制的其他机制，包括其他检查点抑制剂以及阴性调节细胞亚型，例如调节T细胞（Tregs）和髓样来源的抑制细胞（MDSCs）。对于非发炎的表型，需要回答的下一个重要问题是T细胞运输或适当的T细胞启动和激活是否存在缺陷。这些可能是内在的肿瘤（激活改变局部趋化因子状态的致癌途径；存在血管因子，屏障或基质特异性抑制）或对宿主具有特异性。PanCancer IO 360™检测（美国华盛顿州西雅图的纳诺String技术公司）是基因表达测量的研究小组，其设计是在图1中描述的概念框架的背景下进行的，旨在评估与潜在的免疫逃逸机制相关的变量通过治疗干预进行调节。使用770基因表达面板和相关的分析工具和服务套件，使用单一样品进行的单一测定分析了肿瘤免疫基质相互作用。 IO360面板设计用于实体瘤组织（切除活检，芯针活检或切除的材料），并与FFPE，新鲜或冷冻的组织或纯化的RNA兼容。 图1.基于免疫的可操作分类癌症。 Ag =抗原； BETi =溴结构域和末端蛋白的抑制剂；卡波=卡铂; CSF1 =菌落刺激因子1； CFM ＝环磷酰胺； CTLA-4 =细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4； HDAC =组蛋白脱乙酰基酶； HMA =次甲基化剂； IDO ＝吲哚胺2，3-二加氧酶； IO =免疫肿瘤学； LN =淋巴结； LAG-3 =淋巴细胞激活基因3； MDSC =髓样抑制细胞；P13K ＝磷酸肌醇3-激酶； PD-1 =程序性细胞死亡-1； PD-L1 =程序性细胞死亡配体1; STING =干扰素基因的刺激物； TIM3 = T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3； TME =肿瘤微环境； Treg =调节性T细胞； TLR =收费型受体； Wnt =无翼，int-1。 该小组涵盖了大约13种不同的生物学过程和46种原型特征，包括TIS，并允许并行评估在发炎的肿瘤表型的情况下运行的其他免疫逃逸机制（例如其他检查点抑制剂和/或抑制性免疫细胞群或免疫代谢物）以及“免疫排斥”或“免疫沙漠”肿瘤表型（例如影响免疫细胞运输的致癌途径的激活或抗原呈递过程的内在改变）。测量了影响肿瘤免疫反应的关键生物学活性，包括dMMR，抗原呈递，肿瘤细胞增殖，细胞毒性活性，糖酵解和致癌途径。这些生物活动已被捕获为多基因签名。IO360小组支持签名开发，以潜在地预测患者对各种免疫治疗干预措施的反应。在专家组的框架内，肿瘤的生物学可以与特定药物的作用机制相匹配。内容选择该小组以在多种肿瘤类型中提供信息，并且包括多种肿瘤利用的免疫逃逸的概况机制所包括的基因标记；因此，期望能够快速发展新的特征以预测肿瘤对免疫疗法的反应。8. IO生物标志物临床开发中的挑战和未来方向借助提供更丰富的动态免疫肿瘤微环境概况的新型组学技术，免疫肿瘤转化研究的基本挑战不再是研究的目标，而是可以从一个单一且宝贵的临床样本中获得多少信息性数据，以及如何在快速变化的治疗环境中轻松地将数据整合到具有生物学和临床作用的信息中。特别是，除了PD-1–PD-L1和CTLA-4，还开发了其他检查点抑制剂，以及新的IO方法，例如癌症疫苗，带有嵌合抗体受体表达T细胞的过继细胞疗法（CAR-T） ，免疫反应的小分子调节剂（例如toll样受体（TLR）激动剂）和基于核酸的疗法。当这些药物到达诊所后，可能需要新的诊断方法来选择患者，并使用生物标记物来监测免疫反应。竞争小组将需要共同努力，开发针对疾病生物学的通用检测方法，因此可在具有相同作用机制的多种药物中使用。监管机构可能会要求更高的功效（即，对可能有益的亚群进行更准确的定义），从而进一步促进对准确而精确的预测性测试的需求。通过同时分析数百或数千个基因，下一代技术可提供大量数据，这些数据可用于确定可操作的突变，从而指导治疗决策。诸如IO360泛癌工具之类的测定方法可以根据给定肿瘤和宿主免疫系统的生物学特性来测量和整合多个信号。理想情况下，“通用测试”将为所有治疗方式（免疫肿瘤学，靶向治疗，化学疗法）以及给定患者给定药物的受益风险特征提供一组明确的治疗选择。致谢：NanoString Technologies的研究资金为手稿撰写提供了支持。作者贡献：莎拉·沃伦（Sarah Warren）和亚历山德拉·切萨诺（Alessandra Cesano）撰写并审查了手稿。作者感谢克里斯汀·戴尔（ChristineDale）为手稿准备工作提供的帮助。利益冲突：Sarah Warren和Alessandra Cesano是NanoString Technologies的员工和股东。 参考文献(只展示部分参考文献内容，查看全部可到原网站查看)1. 法尔科纳（S.E.P. Diamandis； Blasutig，I.M.癌症免疫疗法：癌症终结的开始？BMC Med。2016，14.[CrossRef]2. 艾尔斯（M.朗塞福德，J。 Nebozhyn，M .；墨菲（E.罗伯达（A.）考夫曼;奥尔布赖特郑京东; Kang，S.P .；香卡兰（V.）等。 IFN-γ相关的mRNA谱预测对PD-1阻断的临床反应。J.临床。调查。 2017，127，2930–2940。[CrossRef] 点击：查看更多医学类文章 查看更多生物学类文章 免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息，仅代表作者个人观点，与本网无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。
2020-12-21 18:18:42
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患者核细胞揭示环状线性RNA高活性疾病生物标志物（上）
具有脂质特异性寡克隆IgM谱带特征的患者外周血单个核细胞的全转录组分析揭示了两个环状RNA和两个线性RNA作为高活性疾病的生物标志物 患者核细胞揭示环状线性RNA高活性疾病生物标志物（结论） Leire Iparraguirre1，Danel Olaverri 1,2，Telmo Blasco 1,2，LucíaSepúlveda1,3， 塔玛拉·卡斯蒂略（TamaraCastillo-Triviño）4，梅赛德斯·埃斯皮尼诺（MercedesEspiño）5，露西恩·科斯塔·弗罗萨（Lucienne Costa-Frossard）5，阿尔瓦罗·普拉达（ÁlvaroPr ada）6，路易莎·玛丽亚·比利亚（LuisaMaríaVillar 3.5），大卫·奥塔吉（David Otaegui）1.3和梅德·穆尼奥斯·库拉（MaiderMuñoz-Culla）1.3 1 Biodonostia健康研究所神经科学领域的多发性硬化症小组 20014西班牙圣塞瓦斯蒂安； leire.iparraguirre@biodonostia.org（L.I.）; a904612@alumni.unav.es（D.O.）; tblasco@tecnun.es（TB。）; lucia.sepulveda@biodonostia.org（L.S.）; david.otaegui@biodonostia.org（D.O.） 2 Navarra Tecnun-Universidad生物医学工程与科学系， Manuel deLardizábal15，20018西班牙圣塞瓦斯蒂安 3 西班牙多发性硬化症网络，西班牙巴塞罗那08028； luisamaria.villar@salud.madrid.org 4 巴斯克卫生局神经病学系生物dondonia健康研究所神经科学区多发性硬化小组，西班牙圣塞瓦斯蒂安，20014； TAMARA.CASTILLOTRIVINO@osakidetza.eus 5 西班牙马德里28034拉蒙·卡哈尔医院（IRYCIS）多发性硬化病科免疫学和神经病学系； mercedes.espino@salud.madrid.org（M.E.）; lucienne.costa@salud.madrid.org（L.C.-F.） 6 巴斯克卫生局免疫学系生物dondonia健康研究所神经科学领域多发性硬化小组，西班牙圣塞瓦斯蒂安，20014； 收到：2020年10月26日;接受：2020年11月23日;发布时间：2020年11月26日 摘要：抗髓磷脂脂质特异性寡克隆IgM带（LS-OCMBs）的存在已被定义为多发性硬化症侵袭性进化的准确预测指标。但是，这种生物标记物的检测是在脑脊液中进行的，这是一种侵入性很强的液体活检。在本研究中，我们旨在研究具有脂质特异性寡克隆IgM谱带特征的患者的外周血单核细胞（PBMC）中miRNA，snoRNA，circRNA和linearRNA的表达情况。我们纳入了总共89名MS患者，其中47名LS-OCMB状态为阴性，而42名为阳性状态。在发现队列中使用微阵列芯片（miRNA和snoRNA）和RNA-seq（环形和线性RNA）来进行分析研究，并通过RT-qPCR在整个队列中验证了候选对象。候选者的生物标志物潜力通过ROC曲线分析进行评估。 RNA-seq和RT-qPCR验证显示，在LS-OCMBs阳性患者的PBMC中，两个环状RNA（hsa_circ_0000478和hsa_circ_0116639）和两个线性RNA（IRF5和MTRNR2L8）被下调。最后，这些RNA在某些组合中显示出70％的准确度。 hsa_circ_0000478，hsa_circ_0116639，IRF5和MTRNR2L8的表达可能是高度活跃疾病的微创生物标志物。 关键词：多发性硬化；生物标志物转录组微小RNA;环状RNA；寡克隆带 1. 介绍 多发性硬化症（MS）是中枢神经系统（CNS）的一种慢性，炎性，神经变性和脱髓鞘疾病。它被认为是一种自身免疫性疾病，其中外周自身反应性淋巴细胞进入中枢神经系统并产生免疫反应，导致白质和灰质的脱髓鞘性病变[1]。据估计，大约有2到300万人患有MS，它通常会影响20至40岁的年轻人。此外，MS在女性中的流行率是男性的三倍，并且有证据表明该比率在最近70年中有所增加[1]，这是与其他几种自身免疫性疾病共有的现象。 MS的病程和临床表型在患者之间以及同一个人中随时间变化都很大。因此，生物标记物可以帮助诊断，MS表型的分化以及监测疾病的进展[2,3]。 疾病活动性生物标志物可以与疾病的不同病理生理过程相关，并且理想地可以帮助区分具有侵袭性病程的患者和具有良性病状的患者[2]。在这种情况下，抗髓磷脂脂质特异性寡克隆IgM带（LS-OCMBs）限于脑脊液（CSF）的存在已被定义为侵袭性进化的准确预测因子[4]。然而，对于该测试，需要脑脊液样本，这是一种侵入性很强的液体活检。因此，为发现微创生物标志物，例如血液生物标志物，已经付出了巨大的努力[5]。 在这种情况下，基因表达谱研究已被广泛用于新的生物标志物发现，但也阐明了疾病中致病过程的分子机制[6,7]。除了经典的蛋白质编码转录组以外，非编码转录组在过去几十年中也引起了人们的极大兴趣，包括我们小组在内的几位作者都证明了它在MS发病机理中的作用[8-10]。 MicroRNA是研究最好的非编码小RNA类型，尽管其他诸如小核仁RNA也与MS相关[11,12]。 MiRNA是单链小的非编码RNA，它们在转录后水平上调节基因表达，并与目标mRNA结合，并且它们参与几乎所有已知的生物学过程[13]。最近，环状RNA（circRNA）作为RNA领域的新参与者出现，在转录后调控机制中起着重要作用。人们发现它们参与了多个过程，例如肿瘤，代谢和免疫相关途径，因此，它们还与多种疾病（如神经系统疾病和自身免疫性疾病）相关，包括在MS中的一些研究[14-18]。 miRNA和circRNA都被认为是广泛的样品类型，如血液，血清，唾液，尿液和CSF中生物标志物的有前途[19-21]。 鉴于这些证据，并且由于对MS固体，可复制和可及的生物标志物的需求不断增加，我们假设对具有LS-OCMBs特征的患者外周血单核细胞（PBMC）进行的全转录组研究可以揭示新的生物标志物与此稳定的CSF标记相关。这样的生物标记物可以更容易地用于持续监测患者，因为与腰穿相比，血液采样的侵入性较小，副作用较小。 考虑到这一点，在本研究中，我们分析了89例阳性（n = 42）和阴性（n = 47）患者外周血单个核细胞（PBMC）中小的非编码RNA，circRNA和线性RNA的表达。 LS-OCMBs表征，发现两个环状RNA和两个线性RNA，两组之间差异表达，可作为未来高度活跃疾病的血液生物标记。 2. 实验部分 2.1. 患者，样品收集和RNA分离 在征得知情同意后，在医院Ramon y Cajal招募了MS患者。按照标准的Ficol梯度分离方法，采集血样并分离PBMC并在液氮中冷冻直至使用。按照制造商的说明，使用miRNeasy mini试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）分离总RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计（ThermoFisher Scientific，Waltham，Massachusetts，MA，USA）测量RNA浓度，并使用Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies，Inc.）评估微阵列和RNA-seq实验中样品的质量。美国加利福尼亚州圣克拉拉市），在所有样品中获得的RNA完整性数均高于6。如前所述[4,22]，获得了CSF来分析LS-OCMB的状态。 表1总结了患者的主要临床和人口统计学特征。表S1列出了样品的完整列表以及包括每个样品的实验。该研究得到医院伦理委员会的批准（MMC-UEM-2018-01，2018年10月）。该分析队列仅包括女性样本，旨在减少变异的来源，并考虑到该疾病中女性的MS发病率是男性的三倍[1]。 表1.患者的临床和人口统计数据摘要。 *包括分析人群中的患者。年龄-平均（范围）。 LS-OCMB-脂质特异性寡克隆IgM带。 P-正。 N-负数。 F—女。男—男。我们没有年龄数据的验证队列中有7个主题（1个阳性和6个阴性）。 2.2. 芯片分析 使用FlashTag HSR生物素标记试剂盒（Genisphere LLC，Hatfield，Pennsylvania，PA，USA）标记总RNA（200 ng），并与GeneChipmiRNA 4.0 Array（Affymetrix，Santa Clara，CA，USA）杂交，覆盖2578， 2025年和1996年人类成熟的miRNA，pre-miRNA和snoRNA。标记的RNA与阵列杂交，在GeneChip Fluidics Station 450中洗涤并染色，并在GeneChip Scanner 7G（Affymetrix，美国加利福尼亚州圣克拉拉）中进行扫描。 微阵列数据分析是在Transcriptome Analysis Console 4.0软件（Affymetrix，美国加利福尼亚州圣克拉拉）中进行的，仅将RMA + DABG算法应用于人类探针集以进行标准化，检测和汇总。我们在具有正负LS-OCMBs的患者之间进行了经典的差异表达分析，考虑到差异表达那些探针集，这些探针集的p值低于0.01，而绝对倍数变化（FC）值高于或等于1.5。 2.3.RNAseq 在CD Genomics（Shirley，纽约，NY，美国）中进行了文库制备和下一代测序。在文库制备之前，再次使用Agilent 2100生物分析仪测量RNA样品的浓度和质量。标准化后，使用Ribo-ZerorRNA去除试剂盒从总RNA样品中去除rRNA，然后进行纯化和片段化步骤。要构建测序文库，需进行链特异性cDNA合成，将3j末端进行腺苷酸化，然后连接衔接子。对生成的库进行质量控制和标准化过程。配对末端测序是用Illumina HiSeq X Ten PE150（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）进行的。 这项研究中提供的数据（微阵列和RNA-seq实验的原始数据）可在GeneExpressionOmnibus（GEO）中以序列号GSE159036公开获得。 2.4. RNA-Seq数据中的CircRNA检测和定量 首先，检查测序质量，然后使用STAR版本2.5.4b（https://code.google。com /archive /）将读数映射到人类基因组（hg19，从UCSCGenome Browser [23]下载）。p / rna-star /）[24]或BWA版本0.7.17-1（http://maq.sourceforge.net）[25]。随后，通过CIRCexplorer2版本2.3.3（https：//circexplorer2.readthedocs。io/en/latest /）[26]和CIRI2版本2.0.5（https://sourceforge.net/projects/ciri/ ）[27]遵循作者的建议。此外，只有这两种算法支持的circRNA才被视为真正的circRNA，并用于后续分析中，该方法已在其他作者的文献中进行了描述[28]。 CircRNA的表达基于根据CIRI2定量分析的反向剪接连接。滤出低表达（读数总和<10）的circRNA后，使用DESeq2 1.28.1版（http：// www。bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）进行差异表达分析[ 29] R（版本3.6.3）的软件包（https： //R-studio（版本1.0.136）（https://rstudio.com/）中的//www.r-project.org/），以差异形式考虑 表达的circRNA显示p值<0.05和倍数变化高于2。为了选择一组候选物用于验证目的，应用了两个附加过滤器：（1）BaseMean值大于5（BM> 5）和（ 2）删除任何样本中读取计数值为零的转录本。最后，我们选择了十个具有最高绝对倍数变化值的候选circRNA。 2.5. RNA-Seq数据中的线性RNA检测和定量 经过测序和质量控制后，使用Kallisto版本0.44.0[30]算法进行转录本伪比对，鉴定和定量。使用DESeq2软件包进行差异表达分析。在运行DESeq2算法之前，我们应用了具有最小读取次数（大于或等于10的读取次数之和）的过滤器，以删除低表达转录本。对于后续分析，由于检测到大量的转录本且我们的样本量较小，我们添加了一个过滤器，以仅保留最可靠的转录本（有关其读取计数）。因此，我们创建了一个检测过滤器，如下所示：（1）在两个组中都检测到了转录本-在每个组的3个样本中，至少有两个读数的转录本。 （2）成绩单仅在一组中检测到-转录本在阴性的4个样本中至少有两个读数组，但仅在阳性组中有1个样品（仅在阴性组中检测到），并且转录组在3个阳性组中具有至少两个读数，但在阴性组中只有1个读数（仅在阳性组中有）。用该检测过滤器选择的转录本被认为是一致的线性RNA。最后，差异表达的转录本被认为是那些显示p值<0.05和绝对倍数变化值大于2的转录本。为了进行验证，我们选择了十个具有最高绝对倍数变化值并具有指定基因名称的线性线性RNA。 图1总结了所有这些分析实验以及数据分析步骤，工具和过滤器。 2.6. cDNA合成和定量PCR 为了验证候选microRNA，使用TaqManTM Advanced miRNA cDNA合成试剂盒（Applied BiosystemsTM，Foster City，CA，USA）将总RNA（10 ng）反转录为cDNA。为了量化miRNA的表达，我们按照制造商的规程使用了TaqMan Advanced miRNA测定法和TaqMan Fast Advanced预混液（Applied BiosystemsTM，美国加利福尼亚州福斯特市）。 hsa-miR-191-5p的测定用作标准化目的的参考miRNA。 图1.研究摘要，指出分析实验，数据分析工具，过滤器和候选者选择标准。阳性。负数-负数。 DE-差异表达。 FC-倍数变化。 BM-BaseMean。 BSJ-背面接合点。 Padj-调整后的p值。 BWA-Burrows-Wheeler对准器。 为了验证候选circRNA，按照试剂盒操作规程，使用高容量cDNA反转录试剂盒（AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA），使用随机引物将总RNA（500 ng）逆转录为cDNA。使用10 ng cDNA作为模板并使用Power SYBRGreenMaster Mix（Applied BiosystemsTM Foster City，CA，USA）通过以下热循环程序建立PCR反应：温度为50℃持续2分钟，温度为95℃ 10分钟，在95℃持续15 s，在60℃进行1分钟的40个循环，然后进行解离曲线分析。如前所述[18]，使用了不同的引物，以使扩增子跨过反向剪接连接（BSJ）。 EEF1A1和B2M用作参考基因，使用两个基因的平均值进行标准化。熔解曲线中单峰的存在表明扩增的特异性。 为了验证候选线性RNA，按照制造商的规程，使用带有HiFlex缓冲液的miScript II RT（Qiagen，Hilden，德国）试剂盒，用oligo-dT和随机引物将总RNA（500 ng）反转录为cDNA。使用以下热循环程序，以10 ng cDNA为模板并使用miSscript SYBRGreenPCR试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）建立PCR反应：温度为95℃15分钟，40个循环为94℃15分钟s，55℃30 s和70℃30 s，然后进行解离曲线分析。使用QuantiTect引物分析（Qiagen，Hilden，德国）（表S2）进行每个线性RNA的扩增，并将B2M用作标准化的参考基因。熔解曲线中存在单峰表明扩增的特异性。 所有逆转录反应均在Veriti Thermal Cycler（美国加利福尼亚州福斯特城的Applied Biosytems公司进行）中进行，定量PCR反应在CFX384 Touch实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories，Inc.，大力神，加利福尼亚州，美国）。 在运行所有验证实验之前，对circRNA扩增进行了技术验证。随后，按照制造商的说明，使用ExoSAP-IT™PCR产品纯化试剂（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特市）纯化RT-qPCR扩增产物，并对Sanger测序（ABIprism3130）（Applied Biosystems，加利福尼亚州Foster City，美国） 为了检查BSJ的存在。另外，还对PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳以证实单个扩增产物的存在。 在CFX Maestro 1.0（Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）中分析了原始Cq值和熔解曲线。使用2ˆDDCq方法计算以倍数变化（FC）表示的表达水平。 R在RStudio中对DCq数据进行统计分析。数据分布通过Shapiro-Wilk检验进行了测试，分布差异通过学生t检验或非参数Wilcoxon秩和检验进行了评估。在每个circRNA和线性RNA数据集中，在进行统计分析之前先删除异常值样本，然后使用R中的boxplot.stat函数识别这些值。 2.7. 基因超表达测试 为了描述差异表达转录本的功能，基于基因本体论数据库的完整生物学过程（2019年12月9日发布），应用了PANTHER过度表达测试（2019年11月7日发布，Panther [31]）。作为参考背景，我们使用了产生上面定义的检测到的转录本的基因列表。进行Fisher检验，并将假发现率（FDR）校正应用于原始p值，将FDR值设置为低于0.05的显着阈值。 2.8. ROC曲线分析 基于RT-qPCR获得的DCq值，我们在RStudio中的R环境中执行了接收器工作特性曲线（ROC曲线）分析。使用了三个不同的数据集：（1）circRNA验证数据，（2）线性RNA验证数据和（3）两个数据集中的样本以测试转录本的不同组合。鉴于我们只需要包括没有任何缺失值的样本（表S1），因此最后一个数据集较小。用“ Epi”软件包的ROC功能计算出不同转录本的组合。 3. 结果 3.1. microRNA表达谱 微阵列分析能够检测出全部6659个人类探针组（42.45％）中的至少一个样品中的2827个探针组（图2A）。在检测到的探针组中，有33例显示LS-OCMBs阳性和阴性患者之间存在差异表达，更重要的是，显示最高表达的前10个探针组能够根据患者LS-OCMBs的状态对患者进行分组（图2B）。在这10个探针集中，我们可以找到五个成熟的miRNA，两个pre-miRNA和两个小核仁RNA。为了进行验证，我们选择了可以使用TaqMan Advanced miRNA分析的四个成熟miRNA（hsa-miR-6800-5p，hsa-miR-6821-5p，hsa-miR-4485和hsa-miR-4741）。但是，RT-qPCR验证结果并未确认这四个miRNA的改变（图2C）。 3.2. circRNA表达谱 环状转录组的RNA-seq分析流程检测到27,630个真正的circRNA和5431个circRNA（19.6％），总读数≥10（图3A）。差异表达分析显示，两组之间有124个circRNA发生了改变（p <0.05; FC> | 2 |），其中72个被上调，而52个被下调。 我们选择了十个候选circRNA，以在更大的队列中通过RT-qPCR确认它们的差异表达。首先，用于引物扩增的技术测试确认了10种circRNA候选物中有9种进行了单一且特异性的circRNA扩增。circMETRNL是一种在琼脂糖凝胶上未显示出良好扩增和单条带的抗体，因此我们在随后的验证实验中将其丢弃。此外，PCR产物的Sanger测序证实扩增子跨越BSJ（图S1）。如图3C所示，通过qPCR在LS-OCMB阳性患者的PBMC中证实了hsa_circ_0000478和hsa_circ_0116639的较低表达（分别为FC = -1.5和FC = -1.65； p <0.01）。 图2.微阵列表达的miRNA结果。 （A）热图显示了在至少一个样品中表达的miRNA的表达（微阵列强度信号）。 （B）显示最高表达的十个DEmiRNA的表达热图。分层聚类表明，这十个miRNA的表达模式能够根据患者的LS-OCMBs状态对其进行分组。 （C）选定候选miRNA的RT-qPCR验证结果。 P-LS-OCMB阳性。 N-LS-OCMB负状态。 DE-差异表达。 图3.通过RNA-seq进行的circRNA和线性RNA表达谱结果。 （A）火山图显示circRNA阳性和阴性组之间的表达差异（log2 FC），显示所有高于10的样品的读数总和.DEcircRNA以红色突出显示，并且标记那些DEcircRNA的碱基均值高于图5.（B）火山图显示了阳性和阴性组之间线性RNA的表达差异（log2 FC）。差异表达的线性RNA突出显示为红色，标记点的DE线性RNA的p值已调整 <0.01。（C）选定候选circRNA的RT-qPCR验证结果。星号表示统计学上的显着差异（p <0.01）。由于样品量的限制，circ_0000478和circ_0116639验证所包含的样品比其余circRNA多得多（表S1）。 （D）选定的候选线性RNA的RT-qPCR验证结果。星号表示差异具有统计学意义（p<0.05）。P：LS-OCMB的阳性状态。 N：LS-OCMB否定状态。 3.3. 线性成绩单表达谱 在本研究中，我们还通过RNA序列分析了线性转录组，鉴定出115,869个转录本，总读取次数≥10。我们使用检测标准应用了一个额外的过滤器，该过滤器可以识别出具有一致表达模式的84,863个线性RNA，从两组中均检测到92.8％。其中，有2441个转录物被差异表达（p<0.05和FC> | 2 |），两组均检测到1421个转录物（图3B）。其余的转录本是特定于一组的，仅在LS-OCMBs阴性患者的PBMC中表达382份，而在LS-OCMBs阳性的患者中表达638份。 我们选择了十个候选线性RNA来通过RT-qPCR确认它们的差异表达。 更大的队列。如图3D所示，在LS-OCMB阳性患者的PBMC中证实了IRF5和MTRNR2L8的较低表达（两个转录本中FC = -1.33； p <0.05）。差异表达的线性RNA主要在免疫系统的生物过程中富集。图4显示了最有意义和最丰富的术语（FDR<0.01和倍富集> 2）。补体激活，体液免疫应答和I型干扰素信号传导 路径出现在最丰富的术语中。 点击：查看更多生物学文章 使用文档翻译功能 免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。 来源于：mdpi
2020-12-18 18:58:14
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耐力和抵抗力训练对老年人骨骼肌葡萄糖代谢的影响（下）
点击查看：耐力和抵抗力训练对老年人骨骼肌葡萄糖代谢的影响（上） 6.2老年人的耐力训练和糖原合酶途径 运动引起的胰岛素敏感性的改善也与负责葡萄糖利用的代谢途径的改善有关。先前的研究[52]报道，通过超氧化，无氧化葡萄糖处理，对超重，老年人（平均年龄：74岁）的人进行的12周高强度运动训练可提高胰岛素敏感性，表明骨骼肌糖原合成途径得到改善。为支持这一点，据报道，老年人通过耐力训练可增加骨骼肌糖原含量[36,60,62,64]，至少一项研究报告说，他们对运动引起的糖原积累的反应比年轻的同龄人[ 36]。基于这些发现，不足为奇的是，老年人在耐力训练中观察到糖原合酶途径的增强[37]。Bienso等。 [37]报道，健康，瘦弱，老年男性的8周耐力训练增强了糖原合酶途径，而PDH活性（负责葡萄糖氧化）则因摄入葡萄糖而降低。虽然可以从这项研究中得出结论，耐力训练会引起葡萄糖优先朝着储存方向穿梭，而不是氧化，但这项研究更具生理学设计（消耗葡萄糖），导致个体之间胰岛素反应的变化，可能影响了骨骼肌。信号和营养需求。无论如何，这项研究表明，在健康，瘦弱的老年男性中，通过耐力训练改善胰岛素敏感性（通过Matsuda指数测量）与糖原合酶途径的改善平行。 鉴于在老年肥胖个体中，胰岛素诱导的训练诱导增强可能受到损害，而糖原合酶途径的改善似乎可从这些个体中获得。 Ryan等。 [57]报道，接受了为期6个月的耐力运动训练以及饮食引起的体重减轻的老年，超重和肥胖男性，可增加骨骼肌分数糖原合酶活性。此外，干预后的全身胰岛素敏感性与胰岛素诱导的糖原合酶活性的改善有关，与Akt丝氨酸473或AS160苏氨酸642的磷酸化无关。据报道，肥胖者的胰岛素敏感性和胰岛素刺激的糖原合酶活性也有类似的改善，绝经后妇女要进行相同的运动和饮食干预[65]。有趣的是，这项研究[65]报告说，与葡萄糖耐量正常的女性相比，被归类为葡萄糖耐量的女性胰岛素刺激的糖原合酶活性的改善更强。尽管这些先前的研究中包括饮食干预[57,65]，但似乎饮食饮食引起的体重减轻并不是糖原合酶途径改善所必需的，因为仅进行了6个月的耐力训练就可以增加胰岛素刺激的糖原合酶分数活性[66]。此外，已显示仅热量限制对肥胖，老年妇女的糖原合酶途径没有影响[57]。综上所述，这些发现表明，超重，肥胖和/或葡萄糖不耐症的老年人可能无法从改善的Akt或AS160信号中受益，但仍可能由于骨骼的改善而获得了耐力训练的胰岛素敏感性。肌肉糖原合成途径。 6.3老年人的耐力训练和葡萄糖氧化途径 几项研究报告了老年人的线粒体缺陷和氧化能力降低[67-69]。长期以来，耐力运动已被确立为一种在年轻个体中诱导线粒体生物发生的干预措施[70]。早期研究表明，老年人比年轻人更容易受到运动引起的骨骼肌氧化能力的影响。例如，Meredith等。 [36]报告说，中强度耐力训练的12周能够逆转老年患者骨骼肌氧化能力的衰老相关缺陷（〜120％），而年轻人则没有变化。当前的研究表明，骨骼肌线粒体的生物发生增加，并且动态的线粒体裂变和融合响应于耐力训练而发生，而不管其年龄如何[71]。运动引起的骨骼肌过氧化物酶体增殖物激活的受体-γ共激活因子（PGC）-1α的增加，被认为是线粒体生物发生的主要调节剂，发生在年轻人和老年人中[72]，并且可能导致与线粒体含量相关的增加进行耐力训练。 线粒体酶PDH在葡萄糖氧化中起关键作用，并且据报道胰岛素刺激的调节作用随着年龄的增长而减弱[8,41]。重要的是，为期12周的耐力训练挽救了老年人胰岛素刺激的PDH调节中与年龄有关的损伤，同时改善了乳酸反应（降低）[41]。我们的研究[41]与Bienso等人的工作之间存在矛盾的PDH结果。 [37]可能与以下事实有关：在我们的研究中，PDH是针对高胰岛素-正常血糖钳夹而测量的，而Bienso等人则是口服葡萄糖负荷的。 [37]研究和/或前者包括来自两性的数据，而后者只关注男性的反应。总体而言，这些结果表明，随着年龄的增长，关于耐力训练对线粒体生物发生的影响的肌肉可塑性得以保留，从而改善了骨骼肌的氧化能力并增强了胰岛素刺激的PDH调节。 6.4成年人的耐力训练和肌内脂质（IMCL） 据报道，老年人中肌内脂质（IMCL）升高[4,73]，并与胰岛素抵抗相关[4,73,74]。有趣的是，据报道在耐力训练中肌内甘油三酸酯（IMTG）随胰岛素敏感性增加[64,75–78]。 Goodpaster等。 [75]首次发现了运动员的悖论，即年轻耐力训练的个体对胰岛素敏感，尽管IMTG储备增加，相当于肥胖，胰岛素抵抗的2型糖尿病患者。人们认为，耐力运动员不断增加的能量需求，以及线粒体含量和功能的增加，都使IMTG转换率提高（消耗/补充周期增加），从而保护了他们免受胰岛素抵抗[75,79,80]。有趣的是，这种悖论也出现在老年人中，耐力训练会增加IMCL以及胰岛素敏感性[64,76–78]。可以合理地假设，如上所述，由于老年人保留了运动诱发的线粒体生物发生和氧化的可塑性，因此，这些适应措施说明了老年人中IMCL的增加，与他们的年轻人相似。 在发现运动员的悖论之后，研究不再将IMTG视为胰岛素抵抗的直接原因，而是将重点放在与骨骼肌胰岛素抵抗直接相关的脂质中间体包括二酰基甘油（DAG）和神经酰胺[81]上。在老年人中升高[82]。重要的是，在年龄（60-75岁）的16周耐力训练中，据报道肥胖的人会减少骨骼肌DAG（〜-40％）和神经酰胺（〜-30％），运动引起的胰岛素敏感性改善与神经酰胺的下降[64,78]。 总而言之，老年人和年轻人一样，会遇到运动员的悖论，在这种悖论中，耐力训练与增加的IMTG一起提高了胰岛素敏感性。也许更令人感兴趣的是，发现对老年人的耐力训练可减少已知抑制胰岛素信号传导和胰岛素敏感性的IMCL物种，包括神经酰胺和DAG。 7.老年人的抵抗力训练和骨骼肌胰岛素信号传导 不幸的是，抵抗训练对老年人葡萄糖代谢的影响没有受到耐力训练的重视。然而，美国运动医学学院建议将阻力训练作为一种安全有效的老年人生活方式干预措施[83]。与耐力训练一样，耐力训练也与提高成年人的全身胰岛素敏感性和血糖控制有关[2,84–88]。回顾先前发表的抵抗训练研究发现，进行了3-6个月的中等强度抵抗训练的老年人可以使全身胰岛素敏感性提高约10-30％[89]。不出所料，通过抵抗训练，全身胰岛素敏感性的提高与骨骼肌葡萄糖摄取的增加平行。 Bucci等。 [84]证明，肥胖母亲出生的老年妇女与对照组相比，经过4个月的抵抗训练可以使大腿肌肉中胰岛素刺激的葡萄糖摄取正常化（通过8F-氟-2-脱氧葡萄糖和正电子发射断层扫描测量）。尽管有大量文献证明与阻力训练有关的瘦体重增加[90,91]，但胰岛素敏感性的增加不能仅通过肌肉质量的增加来解释[92-94]，这表明骨骼肌胰岛素信号的改善。 7.1老年人的抵抗力训练和骨骼肌胰岛素信号传导 我们以前曾报道，与上，下半身主要肌肉群有关的3个月的中等强度耐力训练，与老年男性和女性的中等强度耐力训练相比，对胰岛素的敏感性增加了类似的程度（〜12％）[2]。像耐力训练的效果一样，我们观察到老年人中苏氨酸642和丝氨酸666部位胰岛素刺激的AS160磷酸化增强。但是，与耐力训练不同，抵抗训练不能挽救胰岛素刺激的AS160丝氨酸588磷酸化引起的与年龄有关的损伤[2]。 AS160的位点特异性磷酸化的调控尚不清楚。然而，对主要人口统计学变量的回归分析确定，体脂百分比是胰岛素刺激的AS160丝氨酸588磷酸化的最强独立预测因子[2]。鉴于体脂是对耐力的响应而下降的，而不是对抵抗力训练的响应，因此，运动训练可能需要减少体内脂肪，以逆转与年龄相关的胰岛素刺激的AS160丝氨酸588磷酸化损伤。关于总蛋白，我们确实观察到了通过抗性训练在年轻人中和老年人中都增加了Akt2蛋白水平的趋势[2]。同样，Holton等。 [93]报告说，单腿力量训练6周可增加非肥胖，年龄（平均年龄：62岁）对照和2型糖尿病男性的骨骼肌胰岛素受体和Akt蛋白水平。有趣的是，仅在运动的腿部观察到Akt升高，表明这些适应是由于局部肌肉收缩而不是其他系统适应引起的[93]。 据报道，除了AS160磷酸化的潜在改善外，骨骼肌GLUT4的蛋白质含量会随着抗性训练而增加，但可能取决于训练前的身体成分和糖尿病状态。在老年非肥胖的2型糖尿病患者中，进行六周的单腿力量训练（每周三次），使运动的腿的骨骼肌GLUT4升高（约40％），但在健康对照中则没有[93]。为了支持这些发现，增加了16周的抵抗力训练。 中年（30-54岁）糖尿病前期肥胖男性的骨骼肌GLUT4蛋白含量[95]，并在诊断为2型糖尿病的中年病态肥胖毛利人和太平洋岛民中增加了GLUT4启动子的低甲基化（促进基因转录） [96]。与这些发现相反，在健康，非肥胖，老年个体中，单腿力量训练6周[93]或全身抵抗训练12周[2]，未观察到骨骼肌GLUT4的变化。总之，至少在非肥胖，健康的老年人中，抗性训练似乎可以增强AS160水平的骨骼肌胰岛素信号传导（并可能增强Akt能力），但可能不会增强GLUT4的表达。相反，患有肥胖症和/或2型糖尿病的老年人似乎对骨骼肌GLUT4蛋白含量的增加更为敏感，这可能有助于他们通过抵抗训练提高胰岛素敏感性。 7.2老年人的抵抗力训练和糖原合酶途径 早期的研究强调了抵抗训练对老年人非氧化性葡萄糖处置的有益作用[97]。米勒等。 [94]报告说，在50至63岁之间的男性中进行16周的抵抗力训练可使胰岛素刺激的非氧化性葡萄糖处置增加40％，可能有助于改善全身胰岛素敏感性（22％），并表明抵抗力训练可以改善骨骼肌糖原代谢。尽管有这一发现，但抵抗训练对糖原合酶途径的影响在老年人中一直存在冲突。据报道，进行了十六周的渐进性抵抗训练，可以改善年龄较大，肥胖，拉丁裔男性和女性2型糖尿病的血糖控制并增加骨骼肌糖原的含量[86]。同样，Holten等。 [93]报告说，健康和2型糖尿病老年人在抵抗力训练6周后都有增加骨骼肌糖原含量（〜16％）和显着增加基础糖原合酶活性（分别〜9％和20％）的趋势。鉴于2型糖尿病患者糖原合酶活性的提高几乎是健康对照的两倍，因此抵抗训练对糖原合酶途径的影响可能取决于训练前的糖耐量和/或胰岛素敏感性。此外，尽管经过6个月的耐力训练或抵抗训练后，全身胰岛素敏感性增加了约20％–25％，但只有耐力训练才能改善老年非糖尿病（非肥胖）男性的胰岛素刺激的糖原合酶活性[ [66]，我们没有观察到在较早，健康（非肥胖）成年人中进行抗性训练时，胰岛素刺激的骨骼肌糖原合酶去磷酸化（糖原合酶活性需要）的变化[41]。综上所述，这些数据表明，抵抗训练对改善患有2型糖尿病的老年人的糖原合酶途径可能特别有效。 7.3老年人的抵抗力训练和葡萄糖氧化途径 抵抗训练在年轻人中对线粒体含量和功能产生了矛盾的结果[98-101]，而在老年人中则观察到了积极的作用[102-105]。 Jubrias及其同事[105]报告说，尽管在进行耐力或阻力训练的老年人中骨骼肌氧化能力得到改善，但线粒体含量仅在阻力训练时才增加。在绝经后妇女中进行6个月的渐进性抵抗训练后，骨骼肌线粒体面积和密度也得到了改善[104]。考虑到阻力训练习惯性地增加了老年人的线粒体含量，而不是年轻人[100,101]，这表明衰老的肌肉可能对各种刺激更为敏感，以促进线粒体含量，从而增强骨骼肌的氧化能力和胰岛素敏感性。 不幸的是，现有研究调查了抵抗训练对 胰岛素刺激的老年人葡萄糖氧化反应稀疏，但已发表了一些有趣的发现。 Miller及其同事[94]在健康的老年人中未观察到响应16周的力量训练后全身葡萄糖氧化的变化。相反，老年肥胖的2型糖尿病患者9个月的抵抗训练后，骨骼肌丙酮酸的氧化（离体测量）增加[106]，这表明葡萄糖氧化抵抗训练的改善可能是特定于骨骼肌。尽管未测量葡萄糖氧化，但我们确实测量了响应于年轻人和老年人的抗性训练的骨骼肌葡萄糖氧化的关键代谢途径[41]。与我们在耐力训练中的发现相似，当针对成年人的葡萄糖摄取进行标准化时，抵抗训练的12周减少了胰岛素刺激的血浆乳酸，这表明改善了糖从有氧代谢中的穿梭[41]。此外，我们报道了老年人对抵抗力训练的反应增强了胰岛素刺激的PDH去磷酸化（负责PDH活性），超过了年轻人的反应[41]。除了改善PDH的调控外，我们还报道了抗性训练上调了骨骼肌MPC1（负责丙酮酸进入线粒体的转运蛋白）[41]。有趣的是，与年轻人相比，这些增加的年龄几乎是年轻人的两倍[41]。总的来说，这些发现表明，通过抵抗训练，老年人可能对线粒体适应特别敏感，包括可以改善胰岛素刺激的骨骼肌葡萄糖氧化的改变。 7.4老年人的抵抗力训练和IMCL 与耐力训练的效果不同，阻力训练似乎没有效果[76,84]或降低了IMCL[84]。例如，Bucci等。 [84]报告说，对于肥胖母亲出生的老年妇女，进行4个月的抗性训练会降低IMCL，而对照组的IMCL没有变化。Ngo及其同事[76]提供的证据表明，抵抗训练十四周对老年男性（平均年龄：72岁）的三角肌IMCL没有影响[76]。有趣的是，该研究[76]还报告说，通过抗性训练，骨骼肌线粒体含量增加（柠檬酸合酶升高）。然而，骨骼肌β-羟酰基辅酶A脱氢酶（β-HAD）是负责脂质氧化的关键酶，并没有改变。这些发现表明，要想使运动员发生悖论（即IMCL存储增加），运动训练的适应性必须包括线粒体含量和脂质氧化的增加。抵抗力训练比耐力训练具有更大的糖酵解需求（和更低的脂质氧化需求）的事实，可能解释了为什么在老年人中，抵抗力训练不会使IMCL储存增加。运动期间使用的肌肉收缩类型也可能在IMCL商店中起作用。 Mueller等。 [107]报告说，偏心运动训练的12周降低了老年男性和女性（平均年龄：80岁）的IMCL，而同心运动则没有效果。总体而言，这些发现表明，抵抗训练期间的代谢需求和肌肉收缩的类型可能在确定IMCL储存是否会响应老年人的抵抗训练而减少或保持不变方面起作用。 8.运动训练对老年人骨骼肌肿瘤坏死因子（TNF）-α的影响 最后，还应注意的是，衰老过程与炎症增加有关，这很可能与年龄相关的胰岛素抵抗有关[108]。骨骼肌肿瘤坏死因子（TNF）-α（一种炎症标志物）据报道与年长者相比增加了[10]。细胞培养中已经建立了TNF-α与受损的骨骼肌胰岛素信号传导和葡萄糖摄取之间的直接联系[109]。此外，已经显示，TNF-α输注可损害健康个体的骨骼AS160磷酸化[110]，提供了进一步的证据，表明该炎症蛋白可能与年龄相关的胰岛素抵抗有关。有趣的是，高强度运动训练（骑自行车和循环训练）[111]，中强度抵抗训练[10]或阻力，耐力和柔韧性训练的组合[112]已被证明可以降低骨骼肌TNF-α。老年人水平。因此，TNF-α或其他炎症标记的降低可能至少部分地有助于运动诱发的老年人胰岛素敏感性的改善。 9.结论 衰老与胰岛素抵抗和2型糖尿病风险增加有关。骨骼肌与年龄相关的结构和代谢变化，包括肌肉质量降低，胰岛素信号传导受损，涉及氧化和糖原合酶途径的葡萄糖利用缺陷，都可能导致胰岛素作用降低。一般而言，耐力训练可增强健康老年人的骨骼肌胰岛素刺激的AS160磷酸化，GLUT4蛋白含量以及糖原合酶和氧化（PDH）途径（表1）。在先前健康的成年人中进行阻力训练可以达到类似的好处，但骨骼肌GLUT4和胰岛素刺激的糖原合酶途径的增强作用可能更有限（表1）。当老年人也被归类为肥胖和/或2型糖尿病时，这些人可能通过耐力或抵抗力训练对糖原合酶途径的改善和GLUT4含量的改善，可能有助于他们通过运动训练改善胰岛素敏感性。 作者贡献：L.A.C.设计评论，解释文献并起草论文。光盘。协助设计评审，解释文献，严格审查论文并批准提交出版的最终版本。 G.S.严格审查了该论文，并批准了提交出版的最终版本。 资金来源：作者声明没有该出版物的资金来源。 利益冲突：作者声明没有利益冲突。 参考文献 1. 考伊（Cowie），哥伦比亚特区；鲁斯特（K.F.）;福特（E.S.）；埃伯哈特（M.S.）伯德-霍尔特（D.D.D.）;李超威廉姆斯（D.E.） E.W. 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2020-12-10 19:37:57
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耐力和抵抗力训练对老年人骨骼肌葡萄糖代谢的影响（上）
营养素 耐力和抵抗力训练对老年人骨骼肌葡萄糖代谢的影响 耐力和抵抗力训练对老年人骨骼肌葡萄糖代谢的影响（下） 来源于：MDPI Leslie A.Consitt 1,2,3，*，Courtney Dudley 4和Gunjan Saxena 1 1 俄亥俄州大学俄亥俄大学生物医学系，美国俄亥俄州45701； 2 俄亥俄州大学俄亥俄肌肉骨骼和神经病学研究所，雅典，俄亥俄州45701，美国 3 俄亥俄州大学糖尿病研究所，雅典，美国俄亥俄州45701 4 俄亥俄州大学生物科学系，美国俄亥俄州45701； 收到：2019年9月16日;接受：2019年10月18日;发布时间：2019年11月3日 摘要：衰老与胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生有关。尽管这个过程是多方面的，但骨骼肌与年龄相关的变化有望导致葡萄糖代谢受损。其中一些变化包括肌肉减少症，胰岛素信号传导受损和葡萄糖利用不平衡。耐力和阻力运动训练已被认可为改善老年人葡萄糖耐量和全身胰岛素敏感性的干预措施。虽然两种运动通常都会提高老年人的胰岛素敏感性，但发生这种运动的代谢途径可能不同，并且可能取决于肥胖和2型糖尿病等既往疾病的状况。在这篇综述中，我们将首先重点介绍骨骼肌与年龄相关的变化，这可能会导致胰岛素抵抗，然后是对老年人对胰岛素刺激的葡萄糖代谢的耐力和抵抗力训练适应性的比较。 关键词：年龄骨骼肌;胰岛素敏感性耐力运动抵抗运动； AS160；丙酮酸脱氢酶糖原 1.年龄和胰岛素抵抗 据估计，60岁以上的人中有30％受2型糖尿病的影响[1]。衰老与葡萄糖耐受不良和全身胰岛素抵抗相关[2-8]，导致这些疾病的因素复杂且可能是多方面的，包括年龄[2]，体育活动减少[9]，发炎[10]，和/或体内脂肪增加[9,11]。由于骨骼肌是胰岛素介导的葡萄糖摄取的主要靶标[12]，因此与年龄相关的该组织的结构和代谢变化也被认为在老年人胰岛素抵抗的发病机理中起主要作用。 2.年龄和骨骼肌萎缩 与年龄相关的肌肉萎缩早在25岁开始，并在之后加速，因此，到80岁时，约40％的外侧股外侧肌（大腿肌肉）丢失了[13]。当前讨论年龄相关的肌肉质量下降（称为肌肉减少症）的许多文献集中在对肌肉力量和力量的不利影响上，导致运动能力丧失和无法进行日常活动，包括爬楼梯和举起物体[14] 。虽然这些显然是至关重要的问题，但也应注意，肌肉减少症对葡萄糖的摄取具有有害作用，因为它减少了胰岛素刺激的葡萄糖处置的可用肌肉量[15]。 Lexell等人的早期工作。 [13]报告说，随着年龄的增长而发生的萎缩是由于I型（氧化性）和II型（糖酵解性）肌肉纤维的损失以及纤维尺寸的减小引起的。 （横截面积）主要影响II型纤维[13]。这些发现后来得到了Coggan及其同事（1992年）的支持[16]，他们报告说，老年人群的腓肠肌IIa型和IIb型截面积与年幼的相比有所减小，尽管百分比没有差异。I型和II型纤维。 除了横截面积的损失外，II型纤维似乎也受到老化过程中葡萄糖代谢的负面影响。单纤维蛋白质组学分析显示，与年轻人相比，经常活动的老年人的II型纤维中参与糖酵解和糖原代谢的蛋白质下调[17]。此外，据报道，与年轻人（约29岁）相比，老年人（~64岁）和年轻人（~29岁）相比，负责胰岛素刺激葡萄糖摄取的转运蛋白GLUT4蛋白在II型纤维中减少，但在I型纤维中没有减少[18]。虽然肌萎缩可能在胰岛素抵抗中起作用，但是骨骼肌内发生的与年龄有关的代谢和细胞变化被认为具有重要作用，并且一直是研究人员试图阐明与年龄相关的胰岛素抵抗的细胞内机制的焦点。目前的审查将概述其中的一些机制，然后进行讨论和 改善老年人胰岛素敏感性的两种有效干预措施的比较：耐力和抵抗运动训练。 3.年龄和骨骼肌胰岛素抵抗 为了研究引起胰岛素刺激的葡萄糖摄取减少的细胞机制，一些研究已经检查了骨骼肌中胰岛素信号传导级联。在人[2,8]和动物[19-21]模型中都报告了骨骼肌胰岛素信号的年龄相关损伤。在健康，对胰岛素敏感的个体中，胰岛素与胰岛素受体结合以启动信号传导级联反应，这涉及胰岛素受体的磷酸化，胰岛素受体底物1（IRS-1）与磷酸肌醇3激酶（PI3K）的缔合，苏氨酸的Akt2磷酸化308和473位丝氨酸，以及AS160在许多位点上的磷酸化，使4型葡萄糖转运蛋白（GLUT4）易位到质膜[22,23]。葡萄糖进入肌细胞（肌细胞）后，会经历非氧化性葡萄糖处置（主要是糖原合成）或线粒体葡萄糖氧化（图1）。 为了研究胰岛素信号传导障碍是否会导致与年龄相关的胰岛素抵抗，我们小组研究了久坐的成年男性和女性，年龄范围广泛（18-84岁），均在基线和60分钟内进行了股外侧肌活检。高胰岛素-正常血糖钳夹[2]。我们确定，随着年龄的增长，胰岛素刺激的AS160在丝氨酸588，苏氨酸642和丝氨酸666（而不是丝氨酸318或751）上的磷酸化会受到损害，并伴随着全身胰岛素抵抗的发生[2]。先前的研究已经确定胰岛素可以诱导AS160在丝氨酸318，丝氨酸588，丝氨酸751和苏氨酸642上的磷酸化[24]，并且这些位点位于Akt磷酸化的共有序列内[24]。有趣的是，胰岛素刺激丝氨酸473上的Akt磷酸化保留在我们的老年人中，这表明已知另一种调节AS160磷酸化的激酶和/或磷酸酶[25–27]在与年龄相关的AS160磷酸化损伤中起作用。无论损伤的来源如何，衰老对胰岛素刺激的丝氨酸588和苏氨酸642磷酸化均具有负面影响，这一事实至关重要，因为据信这两个位点对GLUT4易位性的综合影响最大[24]。 与我们的发现相反，Peterson等人。 [8]，报道了在老年人中AS160上游的损伤，其与体重指数（BMI），脂肪质量和习惯性体育活动相匹配的年轻个体。在那项研究中，高胰岛素血症20分钟后，老年人的骨骼肌Akt活性低于年轻人。不同的发现可能是由于测量了磷酸化与活性之间的关系。然而，也可以想到，Akt测量的时机发挥了作用。我们以前曾报道过，老年人对高胰岛素血症的代谢反应延迟[28]，并且在胰岛素刺激20分钟后，无论年轻人还是老年人都不会达到稳态的葡萄糖摄取。因此它是在老年人中，高胰岛素血症期间骨骼肌Akt活性可能减弱，但在达到稳定状态时，其骨骼肌Akt活性可恢复至其年轻同龄人。但是，仍存在与年龄有关的特定位点AS160磷酸化缺陷，至少部分导致老年人的胰岛素抵抗。迄今为止，还没有已知的研究以人类的纤维类型研究年龄对胰岛素信号的影响。然而，据报道，在老年大鼠中，离体大鼠比目鱼肌（主要是I型纤维）中胰岛素刺激的Akt磷酸化受到了损害，但上表皮比目鱼肌（主要是II型纤维）却没有受损[20]，这表明应该在人类中进行进一步的研究。 图1.人体胰岛素刺激的骨骼肌葡萄糖代谢概述。胰岛素与胰岛素受体结合后，它会激活信号传导级联反应，从而导致4型葡萄糖转运蛋白（GLUT4）易位至质膜，从而促进葡萄糖吸收进入肌肉细胞。进入细胞的大部分葡萄糖要么以糖原的形式存储，要么在线粒体中被氧化，要么转化为乳酸。 IRS-1：胰岛素受体底物1； PI3K：磷酸肌醇3-激酶； GS：糖原合酶； PDH：丙酮酸脱氢酶。 在某些[2,18,29]，但并非所有[29-31]研究中，骨骼肌GLUT4随着衰老而减少。这些不一致的发现可能部分归因于受试者之间的纤维类型差异。加斯特等。[18]报告说，与年轻人（平均年龄：29岁）相比，股外侧肌II型纤维中GLUT4的年长者（平均年龄：64岁）减少了约25％，而在I型纤维中没有观察到差异。尽管整个肌肉中GLUT4的含量很重要，但是响应胰岛素刺激的信号而特别位于质膜中的GLUT4的含量具有更大的生理意义。不幸的是，由于通过传统技术分离质膜所需的组织数量，尚无已知研究调查人类衰老对GLUT4转运的影响。据报道，在老年（24个月）大鼠的股四头肌中，响应胰岛素，GLUT4易位至质膜的能力受损[32]。两者合计，这些结果表明，与年龄相关的胰岛素信号转导障碍可能有助于减少GLUT4从细胞内GLUT4储存囊泡（GSV）到质膜的运输，最终导致胰岛素抵抗和衰老。 4.年龄和非氧化性（糖原合成）和氧化途径 据报道，与年轻人相比，老年人的胰岛素刺激的非氧化处置率降低了[33-35]。尽管非氧化代谢可以包括糖原合成以外的其他途径（即磷酸戊糖和己糖胺生物合成途径），但大多数骨骼肌的非氧化代谢是通过糖原合成途径发生的，这将是本综述的重点。早期研究表明，老年人的静息骨骼肌糖原存储量比年轻个体低约60％[36]，这表明年龄相关的糖原合酶途径受损。支持这一点的是，据报道，与年轻人相比，在老年人中胰岛素刺激的骨骼肌糖原合酶活性降低了[34,37]。 当体重和体重指数相匹配[39]以及将氧化速率归一化为总葡萄糖处置量时[40]，也有证据支持老年人胰岛素刺激的葡萄糖氧化受损。老年人降低了胰岛素刺激的葡萄糖摄取的事实（可能是通过降低的胰岛素信号传导以及可能是如上所述的GLUT4引起的）常常混淆了准确比较负责肌肉内葡萄糖利用的细胞内途径的能力。例如，老年人中细胞内途径的活性降低（氧化或糖原合酶）可能仅归因于进入肌肉的葡萄糖减少（即，葡萄糖可利用性降低）。为了控制老年人降低的葡萄糖摄取量，Gumbiner等人。 [40]使年龄较大的个体的胰岛素刺激的葡萄糖摄取与年龄较小的个体相匹配，并报道了老年人的全身葡萄糖氧化减弱，而两组之间的非氧化代谢（包括骨骼肌糖原合酶测量）相似。根据他们的发现，他们得出结论，与年龄有关的胰岛素刺激的葡萄糖氧化减少可导致与衰老相关的胰岛素抵抗，而与葡萄糖摄取的缺陷无关。 我们的小组推测，在控制胰岛素刺激的葡萄糖摄取时，老年人的肌内葡萄糖可能会优先从氧化运往厌氧代谢。在高胰岛素-正常血糖钳制过程中，我们报道了在正常化后的葡萄糖摄取后，老年人的血浆乳酸水平高于年轻人群。特别令人感兴趣的是，胰岛素刺激的乳酸盐增加与骨骼肌丙酮酸脱氢酶（PDH）调节（磷酸化）受损有关[41]。 PDH是一种线粒体酶，可将葡萄糖（丙酮酸）的副产物转化为乙酰辅酶A，并进入柠檬酸循环进行氧化。其他人也报道了在胰岛素刺激期间老年人骨骼肌PDH通量减少[8]，突显了一种潜在的机制，其有助于减少葡萄糖氧化。综合起来，这些研究提供了证据，表明在胰岛素刺激的情况下，骨骼肌PDH的调节可能会因衰老而受损，从而导致葡萄糖减少 氧化，可能对代谢柔韧性和胰岛素敏感性有不利影响[42,43]。 5.老年人的体育锻炼，运动和胰岛素敏感性 长期以来，体育锻炼与年龄增长的个人优越的健康状况和生活质量的提高相关[44]。哈佛校友健康研究的一项研究表明，没有重大健康风险的老年男性（平均年龄：66岁）可以通过成为“周末战士”（每周至少1000 kcal）来减少死亡的风险[45]，这表明即使每周进行一到两次运动也可以延长一个人的寿命。与不活动的老年人相比，一生中一直活跃的老年人的代谢健康水平更高[46]。许多研究人员认为，随着年龄的增长，体育活动的减少是决定与年龄相关的胰岛素抵抗程度的主要因素[9]。据报道，缺乏运动是造成7％的2型糖尿病病例的原因[47]，而参加运动会增加个人无糖尿病的寿命[48]。鉴于传统研究的重点是尝试确定运动强度对改善胰岛素敏感性的要求，而目前的研究表明，总累积活动时间是最重要的变量改善久坐的人的胰岛素敏感性[49]。考虑到骨骼肌在葡萄糖处置中的重要性，响应运动引起的肌肉收缩而发生的肌肉适应可能有助于改善胰岛素敏感性。尽管不是当前论文的重点，但急性运动对新陈代谢的影响不应忽略，在其他地方进行回顾[50]。许多对照运动训练研究表明，与年轻人相比，老年人的全身胰岛素敏感性和骨骼肌代谢得到改善，从而成为改善或预防老年人群胰岛素抵抗的有效干预措施[2,3 ，51–53]。以下将描述已记录的骨骼肌细胞内适应性变化，这些变化可响应耐力或抵抗力训练而提高老年人的胰岛素敏感性。 6.耐力训练 研究耐力训练对中老年男性影响的早期研究表明，与年轻人相比，他们在全身有氧能力和骨骼肌代谢适应能力方面有相当的提高[54]。随后的研究旨在探讨骨骼肌的细胞机制，耐力训练可改善老年人胰岛素敏感性，包括改善胰岛素信号级联和葡萄糖利用。 6.1老年人的耐力训练和骨骼肌胰岛素信号传导 尽管有报道说耐力训练会增加老年个体的骨骼肌Akt蛋白质含量[37,55]，但当将其标准化为总蛋白质时，似乎不会改变胰岛素刺激的Akt磷酸化水平[2,55]或较年轻的个体[56] 。尽管这些发现暗示由于蛋白质增加，Akt的容量可能会增加，但它们也表明，如果存在改善的敏感性/效率，则它位于Akt的下游。为此，我们的研究小组报告说，在3个月的中等强度耐力训练（VO2peak为70-75％VO2peak）中，无论肥胖和肥胖的年轻人和老年人，在丝氨酸位点588上胰岛素刺激的AS160磷酸化水平升高（〜25％）。妇女[2]标准化为AS160总蛋白时。特别令人感兴趣的是，我们还观察到了老年人（而非年轻人）中胰岛素刺激的AS160苏氨酸642（〜57％）和丝氨酸666（〜80％）磷酸化位点的改善，这表明年龄较大的个体可能对中度的人特别敏感。增强AS160磷酸化的强度耐力训练[2]。虽然尚不清楚AS160丝氨酸666对GLUT4易位的影响，但这些发现支持改善胰岛素敏感性的机制，因为AS160苏氨酸642对葡萄糖的摄取至关重要，丝氨酸588上增强的磷酸化对GLUT4易位具有额外的刺激作用[ 24]。 初步证据表明，老年人体内和年轻人体内脂肪的增加都可能减弱运动训练对AS160的影响。与我们在非肥胖人群中的研究结果相反，在肥胖，年龄较大的成年人（包括饮食引起的体重减轻）中进行了6个月的中等强度（60-70％VO2peak）耐力训练，并未改善胰岛素刺激的AS160磷酸化（使用抗体）设计优先检测位点苏氨酸642）[57]。同样，在年轻的肥胖个体中进行短期训练对胰岛素刺激的AS160磷酸化没有影响[58]。 在过去的几年中，高强度运动训练因其减少的时间投入和提高的年轻人对胰岛素敏感性的能力而备受关注[59]。数据表明，这些胰岛素增敏作用可扩展至老年人[52,60]。此外，据报道，在没有减轻体重的情况下，需要高强度而不是中等强度的运动来改善肥胖，老年个体的全身胰岛素敏感性[52]。最近，Mandrup等。 [60]研究了3个月的高强度有氧运动训练（骑自行车）对久坐，体重正常，绝经后妇女的影响。结果表明，高强度运动可增加胰岛素刺激的葡萄糖摄取和骨骼肌Akt磷酸化（但不包括糖原合酶活性），这与以前的发现不同包括中等强度的运动（在上下讨论）。虽然这是调查高强度运动训练对老年受试者胰岛素信号传导影响的唯一已知研究，但它可能通过与传统的中强度耐力训练不同的细胞机制，提供了改善肌肉中胰岛素作用的证据。有必要进行进一步研究，研究在Akt下游进行高强度运动训练的效果，尤其是在肥胖的老年人中。 除了增强胰岛素信号传导外，在老年人的耐力训练中，增加的GLUT4可用性还可能在改善胰岛素敏感性中发挥作用。据报道，中等强度的耐力训练从7天到6个月不等，可使老年人骨骼肌GLUT4蛋白含量增加10％至106％[2,30,31,37,55,61,62]。有趣的是，最短的培训时间在GLUT4中获得了最大的收益。考克斯等。[30]报告说，在VO2peak为〜75％的情况下连续7天骑自行车1 h，老年女性（54％）和男性（106％）的骨骼肌GLUT4升高，而年轻女性中骨骼肌GLUT4的升高也相似。这些数据以及年轻个体的结果[63]表明，中等强度，高频，耐力训练会在一周内显着增加GLUT4，尤其是如果该肌肉被大量征用（即，骑行过程中的巨大肌群）而没有其他改善的话在随后的几周训练中观察到。与可能会因肥胖而受损的胰岛素信号传导改善不同，据报道，训练导致的GLUT4升高在老年肥胖者中[55]，以及老年2型糖尿病患者[31]。 总而言之，似乎胰岛素信号级联的改善和GLUT4可用性的提高可能至少部分地有助于响应中度至高强度耐力训练的老年非肥胖个体的胰岛素敏感性增强。肥胖和/或2型糖尿病的成年人可以通过耐力训练获得增加GLUT4蛋白含量的好处，这可能有助于通过这类运动训练改善他们的胰岛素敏感性。 点击查看：更多医学文章 免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息之目的，仅代表作者个人观点，与本网无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行操作。
2020-12-10 19:21:04
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自身免疫抗体可以解释COVID-19中的血块吗？
来源于：NIH发表于 2020年11月17日由弗朗西斯·柯林斯博士标题：插图显示带有血小板凝块的血管（黄色）。红细胞（红色），中性粒细胞（紫色）和称为aPL的Y形抗体（白色）在血管中循环。信用：斯蒂芬妮·金/密歇根州医学 对于患有严重COVID-19的人来说，最令人困扰的并发症之一是异常的血液凝结，使他们处于使人中风或心脏病发作的风险中。一项新研究表明，导致COVID-19的冠状病毒SARS-CoV-2并非单独导致血凝块。该病毒似乎释放出神秘的抗体，这些抗体错误地攻击人体自身的细胞而导致血凝块。美国国家卫生研究院（NIH）支持的一项研究在《科学转化医学》（Science Translational Medicine）上发表，该研究在172例接受COVID-19住院的患者的血液样本中至少发现了一种自身免疫抗磷脂（aPL）抗体。那些破坏性自身抗体水平较高的人也有其他麻烦的迹象。它们包括大量粘性的，促进血凝块的血小板和NET，DNA和蛋白质网，称为中性粒细胞的免疫细胞会在不受控制的感染中喷出来诱捕病毒，但这会导致炎症和凝血。这些观察结果以及实验室和小鼠研究的结果表明，控制这些自身抗体的治疗可能有望阻止在COVID-19患者中产生血栓的一系列事件。我们的血管通常会在产生凝血因子和抗凝血因子之间取得平衡。这种平衡使我们能够随时准备在受伤后封闭血管，但除此之外，也可以使我们的血液保持正确的稠度，以使中性粒细胞和血小板不会在错误的时间粘连并形成凝块。但是以前的研究表明，SARS-CoV-2可以使平衡趋向于促进血凝块的形成，引发了关于哪些因素也被激活以进一步推动这种危险的失衡的疑问。要了解更多信息，由NIH国家心脏，肺和血液研究所新招募的Lasker学者Yogendra Kanthi和他的密歇根大学同事Jason S. Knight带领的一组医师科学家研究了各种类型的aPL自身抗体。这些自身抗体是骑士实验室对一种称为抗磷脂综合征的获得性自身免疫性凝血病的研究的主要重点。在患有这种综合征的人中，aPL自身抗体会攻击包括在血管内的细胞在内的细胞表面的磷脂，从而导致凝血增加。这种综合征在其他自身免疫性或风湿性疾病（如狼疮）患者中更为常见。还已知包括COVID-19在内的病毒感染会导致aPL抗体的瞬时增加。研究人员想知道，那些通常在COVID-19中短寿命的aPL抗体是否会引发类似于抗磷脂综合征的疾病。研究人员表明情况确实如此。在实验室研究中，与COVID-19患者的自身抗体一起培养时，健康人的中性粒细胞释放的NET数量是后者的两倍。这与先前在已建立抗磷脂综合症患者的自身抗体的此类研究中所见非常相似。重要的是，他们在实验室的研究进一步表明，使用双嘧达莫数十年来预防血液凝结的药物，可能有助于阻止抗体触发的COVID-19中NET的释放。研究人员还使用小鼠模型来确认来自COVID-19患者的自身抗体实际上导致了血凝块。同样，这些发现与小鼠研究中最严重形式的抗磷脂综合征患者的抗体作用的研究结果十分相似。尽管还需要进行更多的研究，但研究结果表明，针对自身抗体以限制NET形成的治疗可能会改善重症COVID-19患者的治疗效果。研究人员指出，需要进一步的研究来确定首先触发自身抗体的原因以及它们在从COVID-19中恢复的那些抗体中持续多长时间。研究人员已经开始将患者纳入一项中等规模的临床试验中，以对住院COVID-19的患者的抗凝血药双嘧达莫进行测试，以了解其是否可以预防危险的血凝块。这些观察结果也可能影响ACTIV-4试验的设计，该试验正在门诊，住院和恢复期患者中测试各种抗栓剂。Kanthi和Knight建议，对受感染的患者进行aPL抗体测试可能也很有用，以帮助鉴定和改善可能有较高血凝块风险的患者的治疗。希望这一研究路线最终将导致避免严重COVID-19患者这种非常麻烦的并发症的新方法。参考：[1]住院COVID-19的患者血清中的血栓前自身抗体。左Y，埃斯蒂斯（Estes SK），阿里（Ali RA），甘地（AA），雅拉瓦西（Yallavarthi S），施H（Sule G），高克曼（Gockman）K，麦迪逊（Madison）JA，左男（M），亚达夫（Yadav），王J，伍德亚德（W），莱扎克（Lezak）SP，卢戈戈（Lugogo）NL，史密斯（Smith），莫里西（J. ，Kanthi Y，Knight JS。科学翻译医学。2020年11月2日：eabd3876。 点击：查看更多医学文章 查看文献翻译文章免责声明：福昕翻译只充当翻译功能，此文内容及相关信息仅为传递更多信息，仅代表作者个人观点，与本网无关，版权归原始网站所有。仅供读者参考，并请自行核实相关内容。若需要浏览原文、下载参考文献等，请自行搜索文中提到的原文网站进行阅读。
2020-11-19 18:53:48
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患者核细胞揭示环状线性RNA高活性疾病生物标志物（结论
具有脂质特异性寡克隆IgM谱带特征的患者外周血单个核细胞的全转录组分析揭示了两个环状RNA和两个线性RNA作为高活性疾病的生物标志物患者核细胞揭示环状线性RNA高活性疾病生物标志物（上）3.3. 线性成绩单表达谱在本研究中，我们还通过RNA序列分析了线性转录组，鉴定出115,869个转录本，总读取次数≥10。我们使用检测标准应用了一个额外的过滤器，该过滤器可以识别出具有一致表达模式的84,863个线性RNA，从两组中均检测到92.8％。其中，有2441个转录物被差异表达（p<0.05和FC> | 2 |），两组均检测到1421个转录物（图3B）。其余的转录本是特定于一组的，仅在LS-OCMBs阴性患者的PBMC中表达382份，而在LS-OCMBs阳性的患者中表达638份。我们选择了十个候选线性RNA来通过RT-qPCR确认它们的差异表达。更大的队列。如图3D所示，在LS-OCMB阳性患者的PBMC中证实了IRF5和MTRNR2L8的较低表达（两个转录本中FC = -1.33； p <0.05）。差异表达的线性RNA主要在免疫系统的生物过程中富集。图4显示了最有意义和最丰富的术语（FDR<0.01和倍富集> 2）。补体激活，体液免疫应答和I型干扰素信号传导路径出现在最丰富的术语中。 图4. 2441 DEmRNA的基因超表达测试结果。显示了最显着的（倍富集> 2）和富集的（FDR <0.01）GO生物过程。条形根据其FDR值进行着色。 DE-差异表达。 FDR-错误发现率。3.4. circRNA和线性RNA作为高度活跃疾病的生物标志物的评估为了评估四个经过验证的RNA作为LS-OCMB状态血液生物标志物的潜力，我们进行了ROC曲线分析。如表2所示，测试了不同的RNA组合以找到区分两组的最佳性能。我们发现，circRNA和线性RNA的不同组合可改善性能，达到约70％的AUC值。表2.四个候选成绩单和不同组合的ROC分析结果。ROC-接收机的工作特性。4. 讨论区在这项工作中，我们表征了具有明显LS-OCMB状态的MS患者的PBMC的整个转录组。该分析和验证实验表明，LS-OCMB阳性患者的PBMC的整体转录组与LS-OCMB阴性患者的PBMC的整体转录组不同。RNA-seq结果显示，两组之间有124个circRNA和2441个线性RNA差异表达。有趣的是，仅在一组中检测到58％的线性RNA，突显了来自具有不同LS-OCMB状态的患者的PBMC中存在特定的表达模式。是真的;但是，我们的RNA-seq样本数量有限，应谨慎对待这些观察结果。据我们所知，以前没有circRNA与MS相关。 Circ_0000478位于13号染色体，其宿主基因为von Willebrand因子A结构域，包含8个（VWA8）。有趣的是，该基因的线性转录本也是我们数据集中差异表达的线性RNA之一，其折叠变化为-3.23（p = 0.047）。最近已经描述了该转录本，并编码功能仍不确定的线粒体蛋白[32]。关于circ_0116639，它位于22号染色体上，与EP300基因重叠。 EP300是一种组蛋白乙酰转移酶，在我们的研究中被检测到但没有差异表达。 circRNA及其宿主基因表达模式的这些差异揭示了circRNA的生物发生与其宿主基因的生物发生是独立调控的，如先前所述[33]。值得注意的是，干扰素调节因子5（IRF5）是已确认的下调转录物之一，该基因的多态性与国际多发性硬化症遗传学联盟进行的最后一次全基因组关联分析中存在发展MS的风险有关。以及西班牙人群的复制研究[34,35]。此外，该基因中的SNP与CSF中CXCL13的水平增加有关，CSF是与高度活跃的疾病相关的趋化因子[36]。最重要的是，动物模型显示IRF5与小胶质细胞极化有关对中风和阿尔茨海默氏病有炎性反应（M1）[37,38]。正如其他作者在外显子组测序项目中所暗示的那样，这可能暗示了小胶质细胞在更积极的疾病过程中的意义[39]。尽管如此，我们的发现是在外周PBMC中进行的，因此IRF5来源可能是外周单核细胞或巨噬细胞。无论如何，需要进一步的研究来揭示IRF5在高度活跃的MS疾病病程中的意义。另一方面，MT-RNR2像8转录本（MTRNR2L8）是另一种经过验证的线性转录本，在LS-OCMB+组中表达较低，编码在11号染色体上，有趣的是，它跨越了miR-4485茎的位置环定位，是本研究中选择用于验证的四个miRNA之一。根据微阵列数据，miR-4485在MTRNR2L8中被下调在LS-OCMB +组中。 MTRNR2L8是mir-4485的宿主基因这一事实可能解释了，即使无法验证miRNA，这组患者的两个转录本也都被下调了。这些结果表明这两个RNA之间可能存在相互作用，可能与更活跃的疾病有关，但是需要进一步的研究来证实这一假设。根据UniProt的研究，MTRNR2L8具有神经保护和抗凋亡因子的作用，并且发现重度抑郁症患者在特定区域的大脑中MTRNR2L8的含量增加[40]。尽管该基因的功能尚不清楚，但对于MS而言，作为神经保护因子的可能作用非常有趣，因为我们发现该基因在PBMC中被下调。但是同样，应该进行进一步的研究以揭示外周血中MTRNR2L8表达与疾病活动以及这种关系的潜在机制之间的可能联系。基因过度表达测试表明，与补体激活，体液免疫反应和I型干扰素反应有关的生物学过程是最丰富的术语。值得注意的是，IgM抗体的鞘内合成以前与鞘内补体激活相关[41]，并且已经清楚地证明了其在脱髓鞘和轴突损伤中的作用[42]。有趣的是，补体系统的不同组成部分已与MS相关，某些组成部分的血浆水平已被提议作为MS疾病状态生物标志物[43]。值得注意的是，这些过程在具有高活性疾病标志物的患者的PBMC中的改变基因中富集。该分析可能表明这些患者的免疫反应可能改变，这可能解释了其较高的疾病活动性，但仍需要进一步和其他类型的研究来探索这一假设。这项研究的主要目的是鉴定血液中的一种或多种可以区分阳性和阴性LS-OCMB患者的生物标志物，从而可以用作高度活跃疾病的更容易获得的标志物。 ROC曲线分析显示，这些标记组合在一起具有大约70％的准确度，通常被认为是可以接受的性能[44]。考虑到这些都是在血液中测量的，它们可能有助于诊所进行重复测量，而连续采集CSF样品则存在严重缺陷。鉴于他们的有效治疗范围可能比较良性或较不活跃的疾病形式要窄，因此正在努力确定患有高度活跃疾病的患者[45]。与此相一致，已经提出了几种生物标记物来鉴定具有侵略性疾病进程的个体，例如神经丝轻链的CSF水平，CXCL13或CHI3L1 [46-48]。其他作者还报告了具有不同疾病活动的患者之间非编码转录组的差异。 Quintana及其同事研究了一组具有LS-OCMB特征的MS患者和其他神经系统疾病（OND）患者的miRNA在CSF中的表达[49]。他们发现OND组和LS-OCMB +组之间miR-30a-5p，miR-150，miR-645和miR-191的表达存在差异，但他们发现LS-OCB阳性和阴性患者之间没有任何差异OCMB。由于他们的研究与本研究之间的分析平台不同，我们无法检查来自Quintana及其同事的数据中候选miRNA的表达。另一项研究报道，miR-24-3p的血清水平与疾病进展指数相关，通过计算EDSS值除以疾病持续时间得出，但未测量LS-OCMB的状态[50]。最近，长非编码RNA在血液中的表达也被描述为显示根据年龄相关的MS严重程度评分，区分高活跃MS患者与其他病程较轻的患者的能力[51]。所有这些研究都突出了能够识别高活动性疾病患者的生物标志物的需求，以及科学界朝着这个方向所做的努力。此外，鉴于每项研究使用不同的参数来对各组患者进行测量和分类，因此对于什么是侵略性疾病过程的定义达成共识也很重要，这使得它们之间的比较确实具有挑战性[52 ，53]。该组患者的早期识别可以受益于不同的治疗建议，并且；因此，有可能改善疾病的长期结果。我们的miRNA分析研究发现了两组之间差异表达的miRNA，尽管尚未通过RT-qPCR实验验证。在这方面，其他技术（例如液滴数字PCR（ddPCR））可能有助于减少变异性并发现组之间的细微差异。尽管据报道在基因表达研究中使用ddPCR并不会增加灵敏度，并且只要起始物质的量足够多且反应中没有污染物，其性能是相似的[54,55]。尽管如此，在未来的验证项目中可以考虑使用该技术，该项目旨在明确丢弃或将那些miRNA用作生物标志物，以用于更具侵略性的MS疗程。5. 结论总之，我们已经鉴定出在LS-OCMB阳性患者中被下调的两个circRNA和两个线性RNA。我们的发现对于多发性硬化症的生物标志物领域非常重要，因为它们可以有助于识别高度活跃的疾病患者。此外，与其他生物标志物相比，一个重要的优势是可以在血液中检测到它们，从而可以进行连续检测来监测其水平，而腰椎穿刺不建议这样做。为了确定其效用，还需要在更大的人群中进行进一步的研究，但是我们认为，它们可以作为确定哪些患者应进行腰穿以确认其LS-OCMB状态的首选筛查工具。 补充材料：补充材料可以在http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/540/s1上找到。表S1：样品和实验的完整列表，其中包括每个样品。表S2：RT-qPCR实验中使用的测定和引物。图S1：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图像和Sanger测序结果显示circRNA的反向剪接。作者贡献：概念化，D.O。 （DavidOtaegui）和M.M.-C .；方法论（DavidOtaegui），M.M.-C.，L.I.，TB.D.O。（Danel Olaverri）和L.M.V .；验证和L.S .；形式分析，L.I.，D.O.（DanelOlaverri），TB，M.M.-C.，M.E。和L.C.-F .；调查，L.I.，M.M.-C.，M.E.，L.C.-F .；资源，A.P.，T.C.-T.，M.E.，L.C.F.，L.M.V。和D.O. （David Otaegui）；写作-原始草稿，L.I.，D.O。 （David Otaegui）和M.M.-C .；写作-审查和编辑（Danel Olaverri），TB。，Á.P.，TC.C.T.，L.M.V .；可视化，L.I.，D.O. （Danel Olaverri），M.M.-C .；监督，D.O.（DavidOtaegui），美国密西西比州立大学和L.M.V .;项目管理，做。 （David Otaegui）和M.M.-C .；资金收购，L.M.V.，D.O. （David Otaegui）和M.M.C.所有作者均已阅读并同意该手稿的发行版本。资金：这项研究由萨洛德·卡洛斯三世研究所（PI17 / 00189和PI15 /00513），西班牙红色硬化菌（REEM）（RD16/0015/0007和RD16/ 0015/0001），吉普斯夸省理事会（109）资助/ 18）和巴斯克政府（PRE_2019_2_0206）和ELKARTEK计划。致谢：作者要感谢Biodonostia Health Research Institute基因组平台的工作人员。利益冲突：作者声明没有利益冲突。资助者在研究的设计中没有作用。在数据的收集，分析或解释中；在手稿的撰写中，或在决定发表结果时。 参考文献（展示部分文献内容，查看全部可在原网站）1. 菲利皮，M .；Bar-Or，A。 Piehl，F .； Preziosa，P .; Solari，A .； Vukusic，S .；马萨诸塞州罗卡多发性硬化症。纳特版本号Dis。总理。 2018，4，1–27。[CrossRef] [PubMed]2. 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2020-11-18 19:00:00
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